ÖZET
Toxoplasma gondii (T. gondii); sıcakkanlı hayvanların çoğunu ve insanları enfekte edebilen, geniş konakçı yelpazesine sahip zorunlu hücre içi apikompleksan bir parazittir. Bu parazit ile dünya nüfusunun yaklaşık üçte biri enfektedir. Toksoplazmozis, immün sistemi sağlam bireylerde asemptomatik seyrederken, immün sistemi baskılanmış bireylerde ise ciddi klinik tablolara ve ölümlere yol açabilmektedir. Parazit, insanlara kedi dışkısıyla kontamine su ve gıdaların tüketiminin yanı sıra çiğ veya az pişmiş hayvansal ürünlerle, konjenital enfeksiyon ve kan/organ nakliyle bulaşmaktadır. T. gondii, koyun, keçi gibi çiftlik hayvanlarında da sıklıkla saptanmaktadır. Koyun ve keçilerde parazit nedeniyle oluşan klinik tablolar ve abortuslar dünya çapında büyük ekonomik kayıplar oluşturmaktadır. Günümüzde, T. gondii’ye karşı sadece koyunlarda kullanılabilen Toxovax (MSD, Yeni Zelanda) ticari aşısı bulunmaktadır. Bu nedenle zararsız, kolay üretilebilen, parazitin neden olduğu kayıpların önüne geçilebilecek ve tüm canlılarda kullanılabilecek yenilikçi T. gondii aşısına ihtiyaç duyulmaktadır. İmmünoloji, moleküler biyoloji, genetik, biyoteknoloji ve proteomik alanlarındaki gelişmeler aşı çalışmalarına yeni bakış açıları kazandırmaktadır. T. gondii’ye karşı geliştirilen aşı çalışmaları, yeni antijenlerin in vitro taramalar ve biyoinformatik analizler kullanılarak keşfi, çeşitli ekspresyon sistemleri ve yeni adjuvant tiplerinin kullanımı ile hız kazanmıştır. Rekombinant protein aşıları biyoteknolojik aşılar olup çeşitli ekspresyon sistemlerinde hızlı ve kolay üretilmeleri, çok miktarda ve yüksek saflıkta ürün elde edilebilirliği, manipülasyon kolaylığı ve hem hücresel hem de humoral immün yanıtı uyarabilmeleri nedeniyle toksoplazmozise yönelik yapılan aşı çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Biyoteknolojik yöntemler kullanılarak geliştirilmekte olan bu aşılar toksoplazmozise karşı koruyucu immün yanıt sağlamak için umut vaat etmektedir. Bu derlemede, parazitin karmaşık yaşam döngüsü, patogenezi ve konakta oluşturduğu humoral ve hücresel immün yanıtın yanında özellikle, parazite yönelik gerçekleştirilen rekombinant protein aşı çalışmaları hakkında genel bir bakış sunulmaktadır.
GİRİŞ
Toxoplasma gondii (T. gondii) toksoplazmozise neden olan, insanları ve hayvanları enfekte edebilen geniş konakçı yelpazesine sahip zorunlu hücre içi bir parazittir. Yaşam döngüsü içinde yer alan kesin konak kedi ve kedigillerde eşeyli üreme ile oluşan sporozoit, ara konaklarında eşeysiz üreme sonucu oluşan takizoit ve bradizoit olmak üzere üç formu bulunmaktadır (1). Takizoitler, hareket yeteneği yüksek aktif formlardır ve akut enfeksiyona neden olmaktadır. Yapılarında bulunan proteinler sayesinde konak hücreye girerek parazitofor vakuol (PV) oluşturmakta ve konağın immün sisteminden de bu strateji ile korunabilmektedir (2). İmmün sistem baskısından dolayı PV içinde daha yavaş bölünen formlar olan bradizoitler ise kronik enfeksiyonda görülmektedir. Konak canlıda hiçbir belirti göstermeden aylarca hatta yıllarca yaşamını devam ettirebilmektedir (3).
Kedi ve kedigillerde eşeyli üreme sonucunda ookistler oluşur ve uygun koşullarda sporlanarak sporozoit form haline gelirler (4). Takizoitler enfeksiyondan sonra daha yavaş bölünebilen bradizoitlere farklılaşırlar (5). Enfeksiyon immün sistemi sağlam bireylerde asemptomatiktir. İmmün sistemi baskılanmış bireylerde ise ciddi komplikasyonlar görülebilmektedir (6). Bunların yanında toksoplazmozisin nöropsikiyatrik hastalıklar, depresyon ve intihar ile ilişkisi gösterilmiştir (7).
Parazit insanları etkilediği gibi koyun, keçi, domuz gibi çiftlik hayvanlarında da ciddi sorunlar oluşturmaktadır (8). Günümüzde yalnızca koyunlarda kullanımı olan bir aşı (Toxovax®, MSD hayvan sağlığı) mevcut olsa da oluşturduğu riskler nedeniyle insanlarda kullanılamamaktadır. Bu nedenle, insanlarda ve hayvanlarda hastalığın yayılımının önlenebilmesi ve hastalığın yarattığı klinik tabloların engellenebilmesi için güvenilir ve etkili bir aşıya ihtiyaç duyulmaktadır (9).
Rekombinant protein aşılarında patojene ait herhangi bir materyalin direkt kullanılmaması ve buna bağlı olarak enfektif formlara dönüşme riskinin bulunmaması, bu aşıları güvenli hale getirmektedir (10). Bunun yanında üretim prosesinde manipülasyon kolaylığı ve geleneksel aşılara oranla düşük maliyetli üretilmeleri gibi avantajları da mevcuttur (11).
Bugüne dek yapılan aşı çalışmalarında, parazite ait uygun antijenik bölgelerin ve ekspresyon sistemlerinin seçilmemesi, aşı adaylarının düşük immün yanıt oluşturması gibi nedenlerden dolayı hastalığa karşı henüz klinik aşamada bir rekombinant protein aşısı bulunmamaktadır. Ancak gelişen teknolojinin yardımı ile yenilikçi yaklaşımlar, yeni antijen keşifleri, kombine üretim stratejilerinin kullanımı ve parazitin yaşam formlarında görülen stratejik proteinlerin seçimi, etkin rekombinant protein aşılarının geliştirilmesinde önemli rol oynamaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda adjuvantlar ile birleştirilen aşı adaylarının güçlü immün yanıt oluşturması ve fare deneylerindeki hayatta kalma oranlarında görülen artışlar, yapılan rekombinant protein aşılarının gelecekte toksoplazmozise karşı etkili ve güvenli olacağına dair olumlu bir bakış açısı sunmaktadır.
Toxoplasma gondii Genel Bilgi
Toxoplasma gondii ilk kez 1908 yılında tanımlanmıştır. Nicole ve Manceaux, Leishmania ve virüs çalışmaları sırasında kullandıkları Ctenodactylus gundi adlı kemirgende gerçekleştirdikleri deneyler sırasında paraziti ilk defa tespit etmişlerdir (12,13).
1950 yılında Türkiye’de ilk kez bir köpekten T. gondii izolasyonu Baran ve ark. tarafından gerçekleştirilmiştir. İlk insan olgusu 1953 yılında Unat ve ark. tarafından bildirilmiştir. 1970’li yıllarda Türkiye’de parazit bir köpekten izole edilmiş ve daha sonra bir bebekte parazite rastlanmıştır. 1972 yılında Ekmen ve Altıntaş tarafından tespit edilen bu suş T. gondii Ankara suşu olarak adlandırılmıştır (14,15). 2020 yılında yapılan güncel çalışmada suşa ait tüm genom çalışılmış ve NCBI veritabanına T. gondii TR_01 ismi ile yüklenmiştir (16).
Morfoloji ve Yaşam Döngüsü
Toxoplasma gondii’nin yaşam döngüsü incelendiğinde akut enfeksiyona sebep olan takizoit, kronik enfeksiyona sebep olan bradizoit (doku kisti) ve sporlanmış ookistler içerisinde bulunan ve sporozoit adı verilen üç farklı formu bulunmaktadır (1).
Tüm çekirdekli hücreleri enfekte edebilen takizoitler hızlı bölünebilen ve hareket edebilen aktif bir formdur (6). Takizoitler hilal şeklinde olup 2x6 µm boyuta sahiptir. Takizoitlerin yapısında patogenezde başlıca rol oynayan konoid ile mikronem (MIC), roptri (ROP) ve yoğun granüller (GRA) proteinleri bulunmaktadır (3,17). Bu proteinler sayesinde konak hücreye girer ve kendilerini PV ile çevreleyerek ovalleşirler. Hücre içinde tekrarlayan endodiyogeni ile aseksüel çoğalma nedeniyle konak immün sisteminden korunabilmektedir (2).
Takizoitler enfeksiyondan yaklaşık 10-14 gün sonra daha yavaş bölünebilen bradizoitlere farklılaşmaktadırlar (3). Bu form konak dokularında, içinde yüzlerce bradizoit bulunan kistler oluşturarak uzun yıllar canlı kalabilmektedir (5). Kronik enfeksiyondan sorumlu olan doku kistlerinin etrafında konak hücreler bulunması nedeniyle immün sistem elemanlarından kaçabilmektedir. Bozulmamış doku kistleri hastalıkla ilişkili olmamakla birlikte konağın yaşamı boyunca enflamatuvar yanıta neden olmadan varlığını sürdürebilmektedir. Fakat immün yetmezliği olan kişilerde doku kistlerinin yırtılması ile bradizoitler, tekrar takizoitlere dönüşerek hastalığın reaktivasyonuna neden olmaktadır (2,5).
Kesin konak olan kedi ve kedigillerin ince bağırsaklarında eşeyli üreme sonucunda oluşan ookistler dışkılama ile ortama bırakıldığında enfektif değildirler. Havalandırma ve sıcaklığa bağlı sporlanarak enfektif hale gelmekte ve birkaç ay boyunca çevrede canlı kalabilmektedir (4). Sporlanan ookistler içerisinde iki adet sporokist ve her sporokistte dört adet sporozoit olmak üzere toplam sekiz adet sporozoit bulunmaktadır. Sporozoitler subterminal bir çekirdeğe sahiptir ve bol miktarda MIC, ROP ve amilopektin granülü bulundurmasıyla takizoite benzerlik göstermektedir (3).
Şekil 1’de görüldüğü gibi T. gondii iki yaşam döngüsüne sahiptir. Eşeyli döngü kedigillerin ince bağırsağında meydana gelirken, eşeysiz döngü insanların da dahil olduğu ara konaklarda ve kesin konak olan kedigillerde gerçekleşmektedir (6). Son konak kediler parazitin üç formundan herhangi biri ile enfekte olabilmekte ve ookistleri dışkı yolu ile çevreye yaymaktadır (18). İnsanlar ise doku kisti ile enfekte çiğ veya az pişmiş etlerin tüketimiyle, kedi dışkısı ile temasla ya da kedi dışkısında bulunan ookistlerin kontamine ettiği su ve sebzelerin tüketimi ve bunların yanı sıra organ nakli, kan transfüzyonu ve konjenital geçiş yoluyla enfekte olabilmektedir (17).
Toksoplazmozis
Toksoplazmozis, immün sistemi sağlam olan bireylerde asemptomatik seyrederken bazı hastalarda servikal lenfadenopati, miyalji ve hafif grip benzeri semptomlara neden olabilmektedir (1). İmmün sistem yetmezliği olan bireylerde ise hastalığın daha ciddi semptomlarla seyrettiği bildirilmektedir. Ayrıca parazit, oküler ve konjenital toksoplazmozise neden olmaktadır (6). Gebelikte enfeksiyon ölü doğumlara ve abortlara, bebeklerde ise zeka geriliği, körlük, hidrosefali veya diğer doğumsal anomalilere neden olabilmektedir (19). Ayrıca, konjenital enfeksiyona rağmen normal doğan bebeklerde 30’lu yaşlarda toksoplazmik retinokoroidit oluşabilmektedir (20). Organ nakli alıcıları ve kanser hastaları gibi immün sistemi baskılanmış hastalarda birincil enfeksiyon veya tekrar aktivasyon ile ensefalit veya pnömoni gibi komplikasyonlara neden olabilmektedir (4,6). Bu ciddi klinik tabloların yanı sıra toksoplazmozis Alzheimer, bipolar bozukluk, şizofreni, obsesif kompülsif bozukluk, multipl skleroz ve epilepsi gibi nöropsikiyatrik hastalıklarla ilişkilendirilmektedir. Buna ek olarak, yapılan deneysel çalışmalarda toksoplazmozisin depresyon ve intihara neden olabileceği gösterilmektedir (7). Yapılan diğer bir çalışmada T. gondii ile glioma riski arasında anlamlı pozitif bir ilişki gözlendiği belirtilmiştir (21).
Epidemiyoloji
Toxoplasma gondii dünyada oldukça yaygın olup enfeksiyonunun prevalansı üzerine yapılan epidemiyolojik çalışmalar dünya çapında farklılıklar göstermekle birlikte sosyal alışkanlıklar, hava koşulları, yaşam standartları ve coğrafik alan gibi farklı faktörlerin bu hastalığın prevalansını etkilediği bildirilmektedir (1). Afrika, Güneydoğu Asya’nın bazı kısımları ve Latin Amerika gibi gelişmekte olan veya az gelişmiş ülkelerde yüksek toksoplazmozis prevalans değerleri gözlenirken gelişmiş ülkelerde prevalansın düşük olduğu belirtilmektedir (22). 20. yüzyılda Orta Avrupa ülkelerinde seroprevalans değerleri %37-58 arasında değişirken Avusturalya ve Kuzey Afrika’da da benzer oranlar bildirilmiştir. Buna karşılık çoğu Latin Amerika ve Gine Körfezi’ndeki Batı Afrika ülkelerinde yüksek değerler gözlendiği bildirilmektedir (23). Güney Kore’de T. gondii prevalansı %1’in altındayken Brezilya’da bu oran %77’ye kadar ulaşmaktadır (24).
Amerika Birleşik Devletleri (ABD) hastalık kontrol ve önleme merkezi raporlarına göre 2000’li yılların ortalarından sonlarına kadar toksoplazmozis ABD'de gıda kaynaklı hastalıklara bağlı ikinci en yaygın ölüm nedeni ve dördüncü hastaneye yatış nedenidir (1). ABD’de yaşayan insanların %8-22’sinin enfekte olduğu ve Birleşik Krallıkta da benzer bir prevalansın olduğu belirtilmektedir (19). Dünya Sağlık Örgütü, Avrupa’da gıda yoluyla bulaşan hastalık yükünün %20’sinin T. gondii’den kaynaklandığını tahmin etmektedir (25). Yapılan bir çalışmadan elde edilen veriler Almanya’da yaşa bağlı olarak T. gondii enfeksiyon oranının %20 ile %77 arasında olduğunu ve bu durumun muhtemelen çiğ sosis ürünlerinin tüketimine bağlı olarak değiştiğini göstermektedir (26). Bir başka çalışmada ise Paris’te yaşayan kadınlarda çiğ ya da az pişmiş et tüketimine bağlı olarak Londra’da yaşayan kadınlara oranla daha yüksek oranda seropozitiflik saptanmıştır (3).
Dünya’da olduğu gibi Türkiye’de de geniş bir dağılım gösteren T. gondii seroprevalansının belirlenmesinde çeşitli illerde çalışmalar yapılmıştır. 2004-2015 yılları arasında yapılan çalışmalarda seroprevalans değerleri %18 ile %52 arasında değişmektedir (27-29). 2000-2018 tarihleri arasında bölgesel olarak toplanan serum örnekleri incelendiğinde seropozitifliğin Ege Bölgesi’nde %30,5, İç Anadolu Bölgesi’nde %29,5, Marmara Bölgesi’nde %28,8, Karadeniz Bölgesi’nde %21,3 Akdeniz Bölgesi’nde %3 olduğu görülmüştür (14). Hastalığın yayılımdaki en büyük risk faktörünün çiğ veya az pişmiş etler ve iyi yıkanmamış sebze ve meyvelerin tüketimi olduğu saptanmaktadır. Büyük ekonomik kayıplara neden olan bu parazitin yarattığı sorunları azaltabilmek için koruyucu tedbirler ile etkili bir aşının kullanılması gerekmektedir (30).
Patogenez
Toxoplasma gondii konak hücreye giriş yapmak ve konak hücrede proteinlerin ekspresyonunu düzenlemek için MIC, ROP ve GRA dahil olmak üzere birçok protein salgılamaktadır. Konak hücreyle ilk temas yüzey antijenleri tarafından yüzey reseptörlerinin tanınmasıyla başlamaktadır (31,32). Parazit konak canlıya ookist veya doku kisti formuyla girdikten sonra bu iki formdan serbestleşen bradizoit ve sporozoitler ince bağırsak lümenini geçerek enterosit veya lamina propriadaki hücreleri istila etmekte ve sonrasında takizoit formuna dönüşmektedir (3,33). Takizoitlerin yapısında bulunan ROP’ler konak hücrede takizoitin kendini PV ile çevreleyerek ovalleşmesini ve lizozomal enzimlerden korunmasını sağlarken GRA’lar vakuol içinde parazitin çoğalmasında görevlidir. Konak hücrenin sahip olduğu endolizozomal yol ve parazitin sahip olduğu çeşitli sinyal iletim yolakları sayesinde parazit vakuol içinde yaşamını devam ettirebilmektedir (2,31). ROP’ler lokalizasyonlarına bağlı olarak ROP boyun proteinleri (RON) ve ROP proteinleri olarak iki alt sınıfa ayrılmaktadır (32). ROP2, ROP5 ve ROP8 gibi psödokinazların diğer proteinlerle etkileşime girerek T. gondii virülansında önemli bir rol oynadığı bilinmektedir (34). Takizoitlerin apikal ucunda bulunan MIC’ler ise istila sırasında hareketlilik ve bağlanma sağlayan çeşitli proteinlerin üretiminden sorumludur (35). Apikal bağlanma sırasında yüzeyde biriken MIC’lerden türetilen apikal membran antijeni (AMA1) yine bağlanma esnasında salgılanan RON’ler ile birleşmektedir (36). MIC2 proteini konak hücreye tutunmada ve parazit hareketliliğinde rol oynarken virülansta ve konağa bağlanmada MIC1, MIC4 ve MIC6 proteinleri rol oynamaktadır (32). T. gondii’nin konak hücreden çıkışı MIC, RON ve ROP’lerin salgılanmasıyla artan kalsiyum seviyesine bağlı olarak gerçekleşmektedir (36). Bu proteinlere ek olarak BAG1 olarak da bilinen ısı şok proteini 30 (HSP30) ve HSP70 proteini gibi parazitin formuna özgü sentezlenen proteinler olduğu da bilinmektedir. BAG1 takizoitlerin bradizoitlere dönüşümünden sorumlu olan dolayısıyla paraziti çevreden gelebilecek tehlikelerden korumayı sağlayan bir proteindir (37). HSP70 proteini ise B ve yardımcı T-hücre (Th) yanıtlarının oluşmasını sağlayan, konak hücreyi öldürmeden önce takizoit formundan salgılanan bir proteindir (38). Parazitin her üç formunda ortak olarak bulunan proteinlerin toksoplazmozise karşı koruyucu bağışıklığı sağlayacak bir aşının geliştirilmesinde oldukça önemli olduğu belirtilmektedir (35,39).
Toksoplazmozise Karşı Gelişen İmmün Yanıt
Toxoplasma gondii’nin konağa bulaşması sonucu konak hücrede hem doğal hem de adaptif immün yanıt uyarımı gerçekleşmektedir. Bu uyarımın temelinde interlökin-12 (IL-12) ve interferon-g (IFN-g) üretimi yer almaktadır. Kimyasalların yüksek seviyede üretimiyle patojenin yok edilmesini sağlayacak Th1 hücre yanıtı ve antijene özgü öldürücü yanıt oluşturacak CD8+ üretiminin artırılması sağlanır. T. gondii enfeksiyonu sırasında öncelikle, enfeksiyon bölgesinde bulunan hücrelerden kemokin salgılanmaktadır. Doğal immün yanıt hücreleri olan dentritik hücreler (DC), nötrofiller ve makrofajların yapısında bulunan toll benzeri reseptörler (toll like receptor) tarafından parazitin varlığı tespit edilerek ortamda IL-12 salgısı artırılmaktadır. CD4+, CD8+ ve doğal katil (NK) hücreler enfeksiyon bölgesine yönlendirilerek IFN-g üretimi sağlanmaktadır. IL-12 ve IFN-g, enfeksiyonun ilerlemesini engelleyerek konakçı hücrelerin parazitten korunmasında rol alan önemli sitokinlerdir (4,33).
Hücresel İmmün Yanıt
Parazit varlığının vücutta tespit edilmesinin ardından parazitin hücrede çoğalmasını engellemek amacıyla majör doku uyumluluk kompleksinin üretimi (MHC), parazite ait PV’nin oluşumunu engelleyecek genlerin ekspresyonu artırılır. Parazite ait yüzey antijenleri proteozomlar ile parçalanarak MHC-I ile hücre yüzeyinde sunulmakta ve CD8+ Th yüzeyinde bulunan Th reseptör ile MHC-I-Ag kompleksi oluşturulmaktadır. MHC-I ile CD8+ koreseptörü arasında güçlü bir kompleks sağlanmaktadır. Antijen sunan hücreler (APC) yüzeyinde yer alan CD80/86 molekülü ile CD8+ Th yüzeyinde bulunan CD28 reseptörü kompleks oluşturarak uyarımı artırmaktadır. CD8+ T perforin ve granzim salgıları ile APC üzerinde sitotoksik etki oluşturulmaktadır. Ayrıca, CD8+ Th’leri IFN-g salgılayarak APC’den indüklenmiş nitrik oksit sentetaz salgısı ile hedef organizmanın ölümünde rol oynamaktadır (40).
Hücresel immün yanıt gelişiminde diğer bir yolak olarak patojene ait antijenler, APC tarafından peptitlerine ayrılırlar ve MHC II reseptörlerine bağlanıp APC yüzeyine iletilerek CD4+ T lenfositlerine sunulmaktadır. CD4+ T lenfositlerinin aktivasyonu CD3 koreseptörü ile gerçekleşmektedir. Bu aktivasyon, CD4+ Th yüzeyinde bulunan CD28 ve CD40L reseptörlerinin APC yüzeyinde yer alan CD80/86 ile CD40 reseptörlerinin birleşmesi sonucunda artırılmaktadır. MHC II-antijen kompleksi oluşumuyla APC’den IL-12 salgılanarak Th0 hücrelerinin Th1 hücrelerine dönüşümü sağlanmaktadır. Th1 hücrelerinin aktivasyonu, bu hücrelerden IFN-g üretilerek NK hücrelerinin ve makrofajların üretimi ile hücresel immün yanıt oluşturulur. Makrofajlardan IL-12 salgılanmasıyla Th1 hücreleri miktar olarak artırılarak hücresel yanıtın güçlendirilmesi sağlanmaktadır (41,42). Aynı zamanda CD4+ hücreleri B lenfositleri uyararak humoral immün yanıtın oluşmasını sağlamaktadır (33).
Humoral İmmün Yanıt
Toxoplasma gondii antijenleri antijen sunan hücreler tarafından alınıp işlenerek MHC-II ile hücre yüzeyinde CD4+ Th’lere sunulmaktadır. CD4+ T hücreleri B lenfositlerini aktif hale getirerek plazmositlerin oluşumunu sağlamaktadır. T. gondii’nin neden olduğu enfeksiyona karşı gelişen humoral immün yanıtta görev alan plazma hücreleri IgM, IgG, IgA ve IgE üretimi gerçekleştirmektedir. Akut enfeksiyon sırasında IgM antikorunun yanında IgA ve IgE artışının da olduğu bildirilmektedir. Enfeksiyondan yaklaşık üç hafta sonra IgG antikorları ortaya çıkmaktadır. Üretilen antikorlar sayesinde parazitin konak hücrelere bağlanmasının engellenmesi ve klasik kompleman sistemin aktivasyonu sağlanmaktadır (4,40).
Toxoplasma gondii Genetik Çeşitliliğinin Aşı Çalışmalarındaki Önemi
Parazit, dünya üzerinde farklı coğrafik bölgelerde çeşitli tiplerde görülmektedir (43). T. gondii ile ilgili yapılan genetik çalışmalarda parazite ait soylar Tip 1, Tip 2, Tip 3 ve atipik olarak sınıflandırılmıştır (14). Sınıflandırmada genetik olarak birbirlerine yakın olan bu tiplerin patojenitelerinin birbirinden farklı olduğu gösterilmiştir. Farelerde yapılan deneylerde Tip 1 suşların tek bir canlı organizma varlığında dahi öldürücü olduğu görülmüştür. Tip 2 ve 3 suşlar Tip 1’e oranla daha az patojeniktir ve kronik enfeksiyon oluştururlar (4). Tip 1 suşlar ile enfekte olan konakçı immün sisteminde DC ve CD8+ Th uyarısının az olduğu, Tip 2 suşlar ile oluşan immün sistem tepkilerinde ise bu hücrelerde güçlü yanıtlar oluştuğu bildirilmektedir (44). T. gondii’ye ait 3 suş arasındaki bu farklılıklar yanında konakta akut ve kronik enfeksiyon sırasında oluşan patolojik farklılıklar, yoğun granül ve ROP salgı proteinlerinin varlığı ve ekspresyon düzeylerindeki değişimlerden kaynaklandığı bildirilmektedir. Atipik suşlar ile ilgili ise henüz çok fazla bilgi bulunmamaktadır (43). Tip 1, Tip 2 ve Tip 3 suşlar, Kuzey Amerika ve Avrupa’da yaygın olarak gözlemlenirken Güney Amerika’da ise başta atipik ve Tip 2 suşları yaygındır (45). Yapılan diğer çalışmalarda ise konakçının herhangi bir suş ile enfekte olması bir başka suşla tekrar enfekte olarak süper enfekte olabileceğini göstermektedir. Bu durum, konakçı immün sisteminin parazite ait farklı suşlar ile enfekte olma durumunda koruma sağlamadığını ve parazitin konakçı immün yanıtından kaçmada farklı stratejiler geliştirdiğini açıkça göstermektedir (4). T. gondii’ye ait karmaşık yaşam döngüsünün anlaşılmasında suşların genotiplendirilmesi büyük önem taşıdığı yapılan çalışmalarda açıkça görülmektedir (46).
Rekombinant Protein Aşıları
Rekombinant protein aşıları, koruyucu immün yanıt uyarmak amacıyla enfeksiyona neden olan patojenin bir bölgesinin biyoteknolojik olarak üretilip aşı antijeni olarak kullanıldığı aşılardır. Günümüzde çeşitli patojenlere karşı geliştirilen ve geliştirilmekte olan aşılarda yüksek saflıkta rekombinant proteinler kullanılmaktadır. Rekombinant protein biyoprosesinde patojene ait antijenik gen bölgelerinin izole edilerek gen düzeyinde düzenlemeleri yapılmakta ve ardından patojenik olmayan canlılarda (bakteri, maya, böcek ve memeli hücreleri) protein ekspresyonu gerçekleştirilmektedir (47). Gen düzeyinde yapılan düzenlemeler gibi ekspresyon sistemlerinin seçimi de aşı çalışmalarında büyük önem taşımaktadır. Ekspresyon sistemi seçiminde hedef proteinin biyokimyasal özellikleri, hücre içinde salgılanma şekli ve yeri, ekspresyon seviyesi, post translasyonel modifikasyonlar ve proteolitik bozunuma dayanıklılığı gibi birçok faktör rol almaktadır (48). Bakteriyel ekspresyon sistemleri, heterolog proteinlerin üretiminde en çok kullanılan sistemlerden biridir. Hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde hızlı ve kolay üretilmeleri, yüksek ekspresyon seviyelerine sahip olmaları ve genetik manipülasyonlarının kolay olması gibi pek çok avantaj bu sistemlerin tercih edilme nedenlerindendir (49). Protein verimliliğinin artırılmasına yönelik yapılan çalışmalarda, maya ekspresyon sistemlerinin kullanımı büyük önem taşımaktadır. Mayalar, hem manipülasyon kolaylığı sağlamaları hem de ökaryotik organizmalar olmaları sebebiyle rekombinant proteinlerin üretimleri için uygun sistemlerdir. Yapılarında bulunan glikozilasyon ve fosforilasyon yolakları yüksek protein verimliliği sağlamaktadır. En çok kullanılan maya olan Saccharomyces cerevisiae’de protein üretim verimliliğinin yolaklar üzerinde gerçekleştirilebilecek genetik manipülasyonlar ile artırılabileceğini bildirilmektedir (50). Böcek hücre kültürü sistemleri içinde en çok kullanılan vektör sistemi bakulovirüstür. Böcek ekspresyon sistemlerinde gerçekleşen translasyon sonrası modifikasyonlar ve doğru protein katlanmalarının memeli hücrelerine yakın olması bu sistemlerin kullanılabilirliğini artırmaktadır. Ancak, maliyetlerinin yüksek olması ve üretim zorluğu nedeniyle bakteri ve maya ekspresyon sistemlerine oranla daha az tercih edildiği bildirilmektedir (49). Translasyon sonrası modifikasyonların, glikozilasyon ve fosforilasyon mekanizmalarının doğru bir şekilde gerçekleştiği proteinlerin elde edilmesi için ise yüksek üretim sağlanabilen memeli ekspresyon sistemleri kullanılmaktadır. Bu sistemlerde de zayıf protein üretimi ve maliyetlerinin yüksek olması gibi nedenlerden dolayı kullanım zorlukları görülmektedir (48,49).
Günümüzde kullanımı devam eden ve rekombinant protein teknolojisi ile üretilen ilk aşı Hepatit B’ye karşı geliştirilmiştir. Hepatit B’ye karşı geliştirilen bu aşı yüksek immünojenik özellikte olan virüse ait yüzey antijeninin (HBsAg) maya hücrelerinde (S. cerevisiae) eksprese edilmesi ile oluşturulmuştur (11,48). Rekombinant protein teknolojisi ile oluşturulan diğer bir aşı insan papilloma virüsüne (HPV) karşı geliştirilmiştir. Günümüzde, virüs benzeri partiküller (VLP) kullanılarak hazırlanmış, maya ve böcek hücrelerinde protein ekspresyonları gerçekleştirilmiş iki adet HPV aşısı bulunmaktadır (11,51).
Rekombinant protein aşılarının diğer aşı teknolojilerine göre çeşitli avantajları vardır. Enfeksiyona neden olan patojene ait herhangi bir materyalin direkt kullanılmaması ve saflaştırma işlemlerinde kontaminasyon gerçekleşme ihtimalinin düşük olması en önemli avantajlardandır. Bunun yanında enfektif formlara dönüşme risklerinin az olması da bu aşıları güvenli hale getirmektedir (10). Ayrıca, geleneksel aşılara oranla rekombinant protein aşılarının üretim maliyetleri oldukça düşüktür (11). Üretim aşamasında uygun promotörlerin kullanımı ve proteinin salgılanması sırasında kullanılan sinyal dizilerinin eklenmesi gibi düzenlenmeler sayesinde yüksek miktarda ürün elde edilebilmektedir (10,48). Bunların yanında, rekombinant protein aşılarının dezavantajlarının bulunduğu noktalar da bulunmaktadır. Konak hücrede hedef proteinin proteolitik stabilitesinin korunma güçlüğü ve translasyon sonrası modifikasyonların doğru şekilde gerçekleşmeme riskleri önemli dezavantajları arasındadır. Ayrıca, oluşturulan rekombinant proteinin tek başına güçlü bir immün yanıt oluşturamaması nedeniyle, protein ile birlikte çoğunlukla kimyasal yapıda adjuvantların kullanımına gerek duyulmaktadır (47).
Rekombinant Protein Aşılarında Kullanılan Adjuvantlar
Aşılar ile oluşturulmak istenen kalıcı ve güçlü immün yanıtın elde edilmesi amacıyla kullanılan adjuvantlar, rekombinant protein aşılarının önemli biyolojik bileşenleridir (52). Geleneksel aşılarda yüksek düzeyde immün yanıt oluşturmaları nedeniyle yeni nesil aşılara oranla daha az adjuvant kullanımına ihtiyaç duyulmaktadır. Ancak, yeni nesil aşılarda gen düzeyinde yapılan manipülasyonlar sonucu yüksek saflıkta ürün elde edilmesi ve buna bağlı olarak aşılama sonucu hedef canlıda güçlü bir uyarım elde edilmemesi için adjuvant kullanımına olan ihtiyaç artmaktadır (53). Adjuvantlar, bağışıklık sisteminde yer alan antijen sunan hücreleri uyararak adaptif bağışıklığın etkin çalışmasını sağlamaktadır. Bu sayede CD4+ T yardımcı hücrelerinin aktivitelerini artırılmaktadır. Uyarılan Th1 hücreleri, bellek oluşumundan ve antijene spesifik antikor üretiminden sorumlu B-hücrelerin ve CD8+ Th’lerinin aktivitelerinin artırılmasını sağlamaktadır. Bu sayede, aşılama sonucu yüksek immün yanıt elde edilmesi ve bellek oluşumu hedeflenmektedir (54).
Aşı çalışmalarında kullanılacak antijen, aşının uygulanma şekli ve oluşabilecek olası yan etkiler adjuvant seçiminde önemli faktörlerdir. Genellikle, adjuvantların güçlü immün yanıt oluşturmaları, biyolojik olarak parçalanabilir yapıda olmaları ve raf ömürlerinin uzun olması istenmektedir (55). Günümüzde aşı çalışmalarında tasarım stratejisine bağlı olarak değişen ve yaygın olarak kullanılan adjuvant tipleri ve oluşturduğu immün yanıtlar Tablo 1’de özetlenmiştir.
Toxoplasma gondii’ye Karşı Geliştirilmiş Rekombinant Protein Aşıları
Parazitin hem insan hem de hayvan sağlığı üzerinde oluşturduğu sorunlar nedeniyle ülkeler ekonomik olarak etkilenmektedir. Günümüzde yalnızca koyunlarda yaşanan ölü doğumları önlemeye yönelik canlı zayıflatılmış bir aşı (Toxovax®, MSD Hayvan sağlığı) bulunmaktadır (9). Ancak, ticari olarak kullanılan aşının virülan suşlara dönüş riski, raf ömrünün kısa olması gibi birçok olumsuz durum vardır. Geleneksel aşılara oranla yeni nesil aşıların güvenilir olmaları, üretimlerinin kolay ve düşük maliyet ile gerçekleştirilmeleri nedeniyle rekombinant protein aşıları son yıllarda büyük bir değer kazanmıştır. Aşılarda kullanılabilecek yeni antijenlerin keşfi ve tasarım aşamalarında stratejik bölgelerin manipülasyonu aşı çalışmalarında önemli bir yere sahiptir.
Gelişen teknoloji ile adjuvant kullanımının çeşitlendirilmesi ve kombine üretim stratejilerinin kullanımıyla rekombinant protein aşı çalışmalarında karşılaşılan güçlükler azaltılmaya çalışılmaktadır. Son yıllarda, T. gondii’nin patogenezinde rol oynayan proteinlerin seçilmesi, uygun ekspresyon sistemlerinin tercih edilmesi sonucunda toksoplazmozise yönelik aşı çalışmaları da Tablo 2’de gösterildiği gibi hız kazanmıştır. T. gondii’ye karşı geliştirilen rekombinant protein aşı çalışmalarında parazite ait SAG proteinleri başta olmak üzere GRA, BAG, SRS, MIC ve çeşitli ROP proteinleri aşı adayı olarak kullanılmıştır. Bunların içinde en sık kullanılan antijenler SAG1, GRA1, ROP2, ROP18 olup, bu proteinlerin daha çok parazitin patogenezinde konakçı yüzey reseptörlerinin tanınması, konak hücre lizozomal enzimlerinden korunma ve takizoitlerin PV içinde çoğalması gibi önemli rolleri bulunmaktadır. Bu çalışmalara örnek olarak, T. gondii’ye ait ROP13 antijenik bölgesi kullanılarak yapılan bir aşı çalışmasında bakulovirüste protein ekspresyonu gerçekleştirilmiş ve çalışma sonucunda hayatta kalma zamanında uzama gözlemlenmiştir (135). Yapılan çalışmalarda ekspresyon sistemi olarak bakteri, maya, böcek ve memeli sistemleri seçilmiştir. Bunların içinde heterolog proteinlerin üretiminde bu sistemlerin kullanılabilirliğinin en büyük sebepleri standardizasyonlarının ve manipülasyonlarının kolay, üretim maliyetlerinin düşük, ve hızlı sistemler olmasıdır. Parazite ait önemli salgı proteinlerinden biri olan SAG1 proteini ile virüs benzeri partikül (VLP) kombinasyonu kullanılan diğer bir çalışmada Sf9 böcek hücrelerinde protein eksprese edilmiş ve aşılama sonucunda güçlü bir immün yanıt elde edilerek hayatta kalma süresinde uzama sağlanmıştır (137). Aşı çalışmalarında mineral tuzları, lipid partiküller, immünostimülatör adjuvantlar, mikropartikül adjuvantlar ve mukozal adjuvant tipleri kullanılmıştır. Diğer bir örnek çalışmada ise MIC3, ROP8 ve SAG1 proteinleri Freund ve CaPNs adjuvantları ile birleştirilerek bakteriyel sistemde eksprese edilmiştir. Aşılama sonucunda immün yanıtta güçlü bir uyarılma gerçekleşmiş ve korunma zamanında uzama gözlenmiştir (142). Aşı çalışmalarında uygulama yolu olarak ise daha çok subkütan (S.C., deri altına) yol seçilmiş olup intramusküler (I.M., kas içine), intranasal (I.N., burun içine) ve intraperitoneal (I.P., periton içine) uygulama yolları da oldukça sık kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar incelendiğinde yıllar içinde en kuvvetli immün yanıt ve/veya korunmanın SAG ve GRA antijenleri ile elde edildiği görülmektedir. İlgi çekici ve yenilikçi araştırmalardan bir diğeri SAG1, AMA1, ROP2 ve GRA4 proteinlerinin biyoinformatik yöntemlerle T ve B hücre epitoplarının tahmin edilmesiyle MHC moleküllerine bağlanma yeteneklerinin tespitine dayanmaktadır. Bu multimerik aşı çalışmasında proteinlerin PLG mikropartikül adjuvantı ile kullanımı sonucu kontrollere oranla yüksek düzeyde Th1 yanıt, spesifik antikor titreleri, IFN-y ve IL-2 seviyelerinde artış ve hayatta kalma oranlarında ciddi uzamalar sağlanmıştır (124). Son olarak, yakın zamanda yapılan güncel bir çalışmada ise takizoit yüzeyinde bulunan T. gondii ribozomal protein P2 (TgRPP2) aşı adayı olarak seçilmiştir. İlgili protein prokaryotik ekspresyon sisteminde eksprese edilerek çeşitli saflaştırma işlemlerinin ardından farelere düşükleri. Aşılama sonucunda farelerde in vivo deneyler ile yüksek antikor seviyeleri, sitokin ve MHC üretimleri saptanmıştır. Bu moleküllerin üretimi sayesinde farelerde hayatta kalma seviyelerinde ciddi uzamalar gözlemlenmiştir. Sonuçlara bakıldığında TgRPP2 aşılamasının toksoplazmoz için potansiyel bir aşı adayı olduğu bildirilmektedir (144).
SONUÇ
Toxoplasma gondii enfeksiyonu sonucunda hem hayvanlarda hem de insanlarda yaşamı zorlaştıran ciddi sağlık sorunları ve ekonomik kayıplar gözlenmektedir.
Parazitin neden olabileceği klinik etkilerin azaltılması, gebelerde oluşabilecek düşüklerin önlenmesi ve başta immün sistemi zayıf olan bireylerde olmak üzere ölümlerin engellenebilmesi amacıyla güvenli, etkili ve kolay elde edilebilir bir aşıya ihtiyaç duyulmaktadır. Tüm dünyada parazite yönelik aşı geliştirme çalışmaları hızla devam etmektedir. Günümüze dek yapılan aşı geliştirme çalışmalarından elde edilen verilerde farelerde güçlü immün yanıt uyarımları, hayatta kalma sürelerinde uzamalar ve parazit yükünde ciddi azalmalar sağlandığı bildirilmiştir. Bu çalışmalarda yenilikçi stratejiler kullanılmaktadır. Özellikle parazite yönelik doğru antijenik proteinlerin ve ekspresyon sistemlerinin seçimi rekombinant protein aşılarının geliştirilebilmesinde büyük önem taşımaktadır. Ancak tüm bunlara rağmen, insanların kullanımına uygun bir rekombinant protein aşısı henüz bulunmamaktadır. Bu durumun temel sebepleri, parazitin karmaşık yaşam döngüsü, konakçı immün sisteminden kaçmaya yönelik geliştirdiği stratejiler ve yapısında bulunan protein çeşitliliğidir. Bunlara ek olarak, parazite ait suş çeşitliliğinin fazla olması, seçilen antijenik bölgenin her suşta etkin yanıtlar oluşturamama riskini ortaya çıkarmaktadır.
Son yıllarda T. gondii’ye yönelik yapılan rekombinant protein aşı çalışmalarında, parazitin yaşam döngüsünde yer alan üç formda da bulunan yüksek antijenik gen bölgelerinin seçimine önem verilmesi, bu bölgelerin uygun ekspresyon sistemleri kullanılarak eksprese edilmesi ve elde edilen proteinlerin seçilen hayvan modellerine uygulanması ile olumlu sonuçlar elde edilmektedir. Rekombinant protein aşılarının canlı ya da inaktif patojen taşımamaları bu aşıları güvenilir hale getirmektedir. Üretimlerinde çeşitli ve düşük maliyetli ekspresyon sistemlerinin kullanılabilirliği sayesinde üretim kolaylığı sağlamaktadır. Aşılama sonucunda hem hücresel hem de humoral immün yanıtta uyarım sağlamaları gibi pek çok olanak ise rekombinant protein aşılarının değerini artıran özelliklerdir. Ayrıca, son zamanlarda suşlar üzerine yapılan genotiplendirme çalışmalarının sonuçları aşı adayı antijen seçiminde suş çeşitliliğinin önemini açıkça gösterilmektedir. Tüm bunlara biyoteknolojik ilerlemelerin de eklenmesi rekombinant protein aşılarının üretiminde kombine stratejilerin kullanım gereksinimini artırmaktadır. Yaşanan bu ilerlemeler, toksoplazmozisin yayılmasının önlenmesi ve oluşturduğu zararların azaltılmasında bir çözüm yolu olarak rekombinant protein aşılarının umut vaat ettiğini açıkça göstermektedir.
*Etik
Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.
*Yazarlık Katkıları
Veri Toplama veya İşleme: T.K., C.G., M.K., A.G., H.C., C.Ü., M.D., A.Y.G., A.D.D., Analiz veya Yorumlama: T.K., C.G., S.E.A., H.C., C.Ü., M.D., A.Y.G., A.D.D., Literatür Arama: T.K., C.G., M.K., A.G., S.E.A., A.D.D., Yazan: T.K., C.G., H.C., M.D., A.D.D.
Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.
Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.