GİRİŞ

Leishmaniasis, parazitik faktörler ve konakçının immün yanıtı arasındaki etkileşime bağlı olarak viseral, mukozal ve kutanöz olmak üzere üç ana klinik durum içeren vektör kaynaklı protozoan bir hastalıktır (1). Hastalığa dünyanın birçok coğrafi bölgesinde bulunan 20’den fazla Leishmania türü neden olmaktadır (2,3). Kutanöz leishmaniasis (KL) ise çeşitli deri lezyonları ile karakterize önemli bir halk sağlığı sorunudur. Çeşitli yerel ve küresel faktörlerin etkisiyle tüm dünyada olduğu gibi Türkiye’de de artan bir eğilim göstermiştir (4,5). KL tedavisinde, lezyonun yeri, sayısı, şiddeti, leishmania türü ve kişinin immün durumuna bağlı olarak, topikal tedavi, sistemik ilaç tedavisi, intralezyoner tedavi yöntemlerinden biri ya da birkaçı birlikte uygulanmaktadır (6). Ülkemizde tedavide ilk tercih edilen ilaç meglumin antimonat bileşikleridir. Fakat meglumin antimonata karşı direncin arttığı çalışmalarda bildirilmiştir. Ayrıca yan etkileri bulunan amfoterisin B, yan etkileri düşük ancak maliyeti pahalı olan lipozomal amfoterisin B ve gebelerde teratojenik etkiler gösterdiği bilinen miltefosinde tedavide kullanılan diğer ilaçlardandır (7,8).

Günümüzde uygulanan tedavi yöntemleri kişinin klinik tablosuna, immün sistemine, etken olan Leishmania türüne bağlı olarak değişmektedir. Leishmaniasis tedavisinde halen yan etkisi standart bir tedavi şeması bulunmamaktadır. Alternatif tedavi arayışları devam etmekte ve bu nedenle, ışık ve ultrason gibi fiziksel mekanizmalara dayalı alternatif anti-leishmanial tedaviler araştırılmaktadır.

Fotodinamik tedavi (FDT), apoptoz veya nekroz ile hücre ölümünü hedefleyen serbest oksijen radikalleri üretmek için ışık ve moleküler oksijen varlığında aktive olan bir fotosensitizer kullanan alternatif bir tedavi yöntemidir. Ayrıca FDT’nin KL üzerinde yapılan çalışmalar gün geçtikçe artmaktadır (9-11). Sonodinamik tedavi (SDT) de FDT’den türetilmiş bir tedavi yöntemidir. FDT’ye benzer şekilde, SDT hedef dokuları toksik olmayan bir sonosensitizer ve düşük yoğunluklu ultrasona maruz bırakmayı içeren güncel bir terapötik yaklaşımdır (12).

SDT’nin biyolojik etkileri ısı, mekanik etkiler ve akustik kavitasyon olmak üzere üç farklı mekanizmadan biriyle ilişkilidir. Kavitasyon ultrasesin doku sıvısında ilerlemesi sırasında meydana gelen basınç değişimlerinden kaynaklanan mikrobaloncukları tarif etmektedir (13). Bu etkiler ultrasonun yoğunluğuna ve frekansına bağlıdır. Yüksek yoğunluklu sonikasyon ısı üretimine yol açarken düşük frekanslı tedavi kavitasyona neden olur. Biyolojik dokuların ultrasona maruz kalması sonucunda, hücrelerde hem yapısal hem de fonksiyonel değişiklikler meydana gelebilmektedir (14).

SDT’nin mekanizması ile ilgili araştırıcılar farklı düşüncelere sahiptir. Bir grup SDT’nin biyolojik etkilerinin, I. termal etkiler: Ultrason enerjisinin emilmesi ve dağıtılması; II. hücre zarı geçirgenliği değişiklikleri veya hücre zarı yırtılması (değişen akustik basınca tepki olarak önceden var olan gaz kütlelerinin salınımları veya mikro baloncukların büyüyüp, kritik bir boyuta ulaştıktan sonra şiddetli bir şekilde patlamasından kaynaklanan kesme kuvvetleri nedeniyle uygulamalar arasında hücre zarı bozulması ve büyük moleküllerin zar ötesi taşınmasına izin veren sonoforez) ve III. serbest radikal oluşumu (çöken kavitasyon mikro-baloncukların içinde bulunan moleküllerin pirolizi ile serbest radikallerin oluşumu) olduğunu düşünmektedir (15). Başka bir grup ise sonodinamik etkiyi moleküllerin sonolüminesans ile elektronik olarak uyarılmasıyla (yani harici aydınlatma uygulaması olmaksızın), ultrason enerjisi ile üretilen sıvılarda akustik kavitasyon sırasında üretilen ışık parlamaları ile açıklar. Sonolüminesans, sitotoksik singlet oksijen oluşumuyla sonuçlanan fotokimyasal süreçleri başlatır (13,16,17).

Sonosensitizerler, bleomisin, adriamisin, amfoterisin B, mitomisin C, daunomisin, diazikuon ve 5-florourasil gibi yaygın olarak kullanılan anti-kanser ilaçları ve hematoporfirin, fotofrin, mezoporfirin, çinko (II)-ftalosiyanin, protoporfirin, ATX-70 [7,12-bis(1-desiloksietil)-Ga (III)-3,8,13,17-tetrametil-porfirin-2,18-dipropionil diaspartik asit], feoforbid a ve rose bengal (RB) gibi birkaç fotosensitizeri içerir (18-24). RB, ksanten türevi bir ışığa duyarlılaştırıcıdır ve görünür ışığa maruz kalma ile yaklaşık %100’lük bir kuantum verimiyle singlet oksijen ürettiği bilinmektedir (25). Ayrıca, RB’nin 514 nm’de ışıkta plazma zarı hasarını ve ayrıca ultrason ile aktive edildiğinde in vitro hücre hasarını indüklemektedir (26,27). Çok sayıda ciddi çalışma kanser hücrelerinin SDT’sine adanmıştır ve bildiğimiz kadarıyla bu teknik, leishmaniasis tedavisi için uygulanmamıştır. RB, SDT için sonosensitizer olarak yüksek potansiyele sahip olmasına rağmen anti­-leishmanial etkisi henüz gösterilmemiştir.

Bu çalışmada RB aracılı SDT’nin Leishmania tropica (L. tropica) promastigotlarına etkisi sitotoksik ve morfolojik açıdan gösterilmesinin yanında ultrases uygulama optimizasyonunun yapılması amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Parazitin Elde Edilmesi ve Üretilmesi

L. tropica promastigotları Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı’ndan Prof. Dr. Hatice Ertabaklar’ın koleksiyonundan temin edilmiştir. Promastigotlar kullanılıncaya kadar sıvı azotta saklanmıştır. Promastigotlar sıvı azottan alınıp hızlı bir şekilde çözdürüldükten sonra %10 FCS içeren RPMI-1640 besiyerinde kültüre alınmıştır. Ekim yapılan flasklar 26 °C’lik etüvde inkübe edilmiştir.

RB’nin Stok Solüsyonlarının Hazırlanması

RB stok sulu solüsyonu (Sigma-Aldrich, ABD) 320 µ konsantrasyonlarında PBS içinde hazırlanmış ve 0,22 µm’lik filtreden geçirilmiştir. Stok 320 µM RB solüsyonu RPMI 1640 hücre kültürü solüsyonu ile ½ seri dilüsyon olacak şekilde hazırlandı. Parazitler dilüsyonlar oluşturulduktan sonra kuyucuklara 1x10⁷ hücre olacak şekilde inoküle edilmiştir ve 80, 40, 20 µM’lik RB konsantrasyonları oluşturulmuştur.

Deney Grupları

Grup 1: Kontrol grubu RB ya da ultrases uygulanmamıştır.

Grup 2: 1x10⁷ promastigot/mL olan parazit örnekleri 20 40 ve 80 µM dozlarda bir saat boyunca karanlıkta 26 °C’de RB’ye maruz bırakılmış ve ultrases uygulanmamıştır.

Grup 3: 1x10⁷ promastigot/mL olan parazit örnekleri 20 40 ve 80 µM dozlarda bir saat boyunca karanlıkta 26 °C’de RB’ye maruz bırakılmış ve daha sonra serbest RB ortamdan uzaklaştırılıp, örneklere 1 MHz frekansta 1, 1,5, 2 W/cm² yoğunlukta örneklere 2 cm mesafeden 10-20-30 dk boyunca ultrases uygulanmıştır.

Grup 4: 1x10⁷ promastigot/mL olan parazit örnekleri 1 MHz frekansta 1, 1.5, 2 W/cm² yoğunlukta örneklere 2 cm mesafeden 10-20-30 dk boyunca ultrases uygulanmıştır.

Sonodinamik Tedavinin in vitro Etkinliğinin Belirlenmesi

RB aracılı SDT için deneysel kurulum Şekil 1’de gösterilmiştir. 1x10⁷ olan L. tropica promastigotları hücre proliferasyonunu belirlemek için değişik dozlarda 1 saat boyunca RB’ye maruz bırakıldıktan sonra örnekler 1500 devirde 5 dakika boyunca santrifüjlenip, dipte kalan çökelti PBS ile 3 kez yıkanmış ve RB uzaklaştırılarak üzerine PBS eklenmiştir. Hücreler 15 mL’lik falconlara aktarılarak suyun içerisinde 1 MHz frekansta 2 cm mesafeden 1, 1,5, 2 W/cm² yoğunlukta ultrasese maruz bırakılmıştır. Bütün ultrases uygulamaları sırasında ultrasesin termal etkisi gözlemlenmiş ve sıcaklık artışı izlenmiştir. Ultrases uygulamasından sonra örneklere taze besiyeri eklenmiş, 18 saat boyunca 26 °C’de inkübe edilmiştir.

XTT [2,3,-bis(2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-2H-tetrozolium-5- kaboksanilit tuzu] Testi

XTT yöntemi kullanılarak RB, RB aracılı SDT ve ultrasesin sitotoksik etkisi değerlendirilmiştir. Örnekler 96’lık mikroplatelerde XTT solüsyonu kullanılarak spektrofotometrik yöntem ile değerlendirilmiştir. Hücre canlılığı yüzdesi,

formülüne göre hesaplanmıştır.

Giemsa Boyama

Kontrol, ultrases kontrol, RB ve RB aracılı SDT grupları için üçer preparat hazırlanmıştır. Her bir gruptan bir miktar parazit örneği alınıp lam üzerine yayılıp kuruması beklenmiş, kuruyan hücrelere metanol damlatılmıştır. Preparatların üzerine bire bir oranında hazırlanan boya damlatılıp 20 dakika boyunca beklenmiş ve ışık mikroskobunda hücre morfolojileri incelenmiştir.

İstatistiksel Analiz

Tüm deneyler, üçlü kuyucuklar da en az üç kez tekrarlanmıştır. Tüm veriler, SPSS 25.0 programı kullanılarak analiz edilmiş ve veri analizi için tek yönlü ANOVA varyans analizi ve ardından Tukey post-hoc testi kullanılmıştır. P-değeri 0,05’ten küçük çıkan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

BULGULAR

Farklı Konsantrasyonlarda Tek Başına RB Uygulamasının L. tropica Promastigotlarının Proliferasyonuna Etkisi

SDT uygulamasına geçmeden önce L. tropica promastigotlarında tek başına RB’nin farklı konsantrasyonlardaki etkisine bakılmıştır. Bunun amacı tek başına RB uygulaması ile L. tropica promastigotlarının etkilenmemesidir. Rose bengal’in 20 µM konsantrasyon uygulamasında kontrol grubuna göre anlamlı fark bulunamamıştır (p=0,152). Diğer konsantrasyonlar 40 µM ve 80 µM RB uygulaması sonrası hücre canlılığında kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalma olsa da RB uygulanan tüm gruplarda hücre canlılığı %85’in altına düşmemiştir (p=0,001; p=0,008). Tek başına RB uygulamasının L. tropica promastigotlarına etkisi saptanmamıştır (Şekil 2A).

Ultrases Uygulama Süresinin L. tropica Promastigotlarına Etkisi

SDT uygulamasına geçmeden önce belirlenmesi gereken bir diğer basamak ise sadece ultrases uygulaması ile L. tropica promastigotlarının etkilenmemesidir. Yani ultrases uygulamasının herhangi bir toksik etkisi olmaması gerekmektedir. Daha önce litaratürde L. tropica promastigotlarına SDT uygulama çalışmaları olmadığından sadece ultrases uygulamasının L. tropica promastigotlarına etkisinin belirlenmesi için süre denemeleri yapılmıştır. Ultrases optimizasyonu için 2 W/cm² yoğunluğunda 10, 20 ve 30 dk boyunca parazitlere ultrases uygulanmıştır. Süre ne kadar artar ise ultrasesin termal etkisinin ortaya çıktığı gözlemlenmiştir. Özellikle 30 ve 20 dk ultrases uygulamalarının hücre canlılığını sırasıyla %41,3 ve %47’ye düşürdüğü tespit edilmiştir. 10 dk uygulamasında ise hücre canlılığı %93,6 bulunduğundan ve tek başına ultrases uygulamasının L. tropica promastigotlarını etkilememesi üzerine tüm çalışmaya 10 dk ile devam edilmiştir (Şekil 2B).

RB Aracılı SDT Uygulamasının Farklı Konsantrasyonlarının L. tropica Promastigotları Proliferasyonuna Etkisi

Farklı konsantrasyonlarda (80 µM 40 µM 20 µM) RB ve farklı yoğunluklarda (2 W/cm², 1,5 W/cm², 1 W/cm²) 10 dakika ultrases uygulamasının 18 saatlik inkübasyon sonuçlarına göre 80 µM 40 µM 20 µM RB ile 2 W/cm² yoğunluklu ultrases birlikte uygulanmasının ultrases-kontrol grubundaki hücre sayısına göre istatistiksel olarak anlamlı azaldığı tespit edilmiştir (p<0,001). 80 µM RB ardından 1 MHz frekansta 2 W/cm² yoğunlukta ultrases uygulama sonrası L. tropica promastigot canlılığı %71,3’e düşmüştür. 80 40 ve 20 µM RB ardından 1 MHz frekansta 1,5 W/cm² yoğunluklu ultrases uygulama sonrası hücre canlılığı sırasıyla %78,5 %78,7 %79 olarak belirlenmiştir. 1 W/cm² yoğunluklu ultrases uygulamasının L. tropica promastigot canlılığı 80 40 ve 20 µM konsantrasyonda sırasıyla %85,6 %86,1 ve %86,7 bulunmuştur. Ultrases kontrol grubunda 2 W/cm² 1,5 W/cm² 1W/cm² yoğunluklu uygulama sonrası ise canlılık sırasıyla; %93,6 %94 ve %94,8 olarak tespit edilmiştir (Şekil 3).

Hücresel Morfolojik Değerlendirme Bulgular

Giemsa boyama bulguları

Giemsa boyama sonuçlarına göre RB ya da ultrases uygulanmamış kontrol grubundaki parazitlerde tek çekirdek, kamçı, kinetoplast ve dar hücre gövdesi ile tipik morfolojik özellikler tespit edilmiştir (Şekil 4).

Sadece ultrases uygulamasının L. tropica promastigotları üzerinde Giemsa boyama sonuçlarına göre, uygulama süresinin artması parazitler üzerinde morfolojik olarak etkilere yol açmıştır. Ultrases süresinin 20 ve 30 dk uygulanmasıyla parazitlerin çekirdeklerinin ve kinetoplastlarının birbirinden ayırt edilemedikleri parazitin tipik formundan uzaklaştıkları kamçılarını kaybettikleri gözlemlenmiştir (Şekil 5A, B). Bu da XTT sonuçları ile uyumluluk göstermiştir. Ultrases süresinin 10 dk uygulanmasının ise parazitleri morfolojik olarak etkilemediği gözlemlenmiştir. Parazitlerde tek çekirdek, kamçı, kinetoplast ve dar hücre gövdesi ile tipik morfolojik özellikler görülmüştür (Şekil 5C). Sadece 80, 40 ve 20 µM konsantrasyonlarında RB uygulamasında da parazitlerin tek çekirdek, kamçı, kinetoplast ve dar hücre gövdesi ile tipik morfolojik özellikleri koruduğu gözlemlenmiştir. Parazitler üzerinde tek başına RB uygulamasının hem XTT hem de morfolojik sonuçlara göre bir etkisine rastlanmamıştır (Şekil 5D-F).

Giemsa ve XTT sonuçlarına göre sadece ultrases uygulama süresi L. tropica promastigotlarının etkilenmediği süre olan 10 dakika olarak belirlenmiştir. Farklı RB konsantrasyonları ve farklı ultrases yoğunlukları arasında morfolojik olarak farklar gözlenmiştir. RB’nin 80 µM konsantrasyonda, 2 W/cm² yoğunlukta, 10 dk boyunca ultrases uygulamasının parazitlerde çoğunlukla yuvarlak, şişmiş, çekirdeği ayırt edilemeyecek atipik formları gözlenmekle birlikte tipik dar hücre gövdesi formları da tespit edilmiştir (Şekil 6A). RB’nin 40 µM ve 20 µM konsantrasyonda, 2 W/cm² yoğunlukta, 10 dk ultrases uygulamasında ise herhangi bir morfolojik değişikliğe rastlanmamıştır. Kontrol grubu hücreleri ile uyumlu morfoloji göstermişlerdir (Şekil 6B, C). RB’nin 80, 40 ve 20 µM konsantrasyonlarında, 1,5 W/cm² yoğunlukta 10 dk ultrases uygulamasından sonra parazitlerin kontrol grubundaki gibi tipik morfolojik özelliklerini koruduğu gözlemlenmiştir. Gruplar arasında morfolojik olarak farklılık gözlenmemiştir (Şekil 6D-F). RB’nin 80, 40 ve 20 µM konsantrasyonlarında, 1 W/cm² yoğunlukta 10 dk ultrases uygulamasında da herhangi bir atipik parazit morfolojisine rastlanmamıştır. Kontrol grubundaki gibi tek çekirdek, kamçı, kinetoplast ve dar hücre gövdesi tipik morfolojik özellikler tespit edilmiştir (Şekil 6G,I).

TARTIŞMA

Leishmaniasis tedavisinde uygulanan yöntemler Leishmania türüne göre farklılık göstermektedir. Her Leishmania türü kendine özgü biyokimyasal ve moleküler özelliklere sahiptir. Bu hastalık grubunun tedavisinde kullanılabilecek, daha önce denenmemiş, yeni ilaçların geliştirilmesi, bitki ekstreleri ve bitkisel kaynaklı anti-leishmanial etken maddelerin araştırılmasının önemli olduğunu vurgulayan araştırmalar bulunmaktadır. Ozbilgin ve ark.’nın (28) 2014 yılında Türkiye’nin belirli bölgelerinden topladıkları bitki ekstraktları ile yaptıkları bir çalışmada Eryngium thorifolium ve Centaureae calolepis ekstraktlarının L. tropica üzerinde hem in vitro hem de in vivo etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Kivçak ve ark.’nın (29) yaptıkları bir çalışmada Arbutus unedo L’nin yapraklarından elde edilen etanol, su ve n-hekzan özlerinin L. tropica promastigotlarına karşı in vitro test edilmiş ve A. unedo yapraklarının etanol ekstresinin diğer ekstrelerden daha etkili olduğunu bildirmişlerdir. Limoncu ve ark. (30) L. tropica üzerine moksifloksasin ve linezolid ile kaspofunginin, potansiyel anti-leishmanial etkilerinin in vitro olarak araştırmışlardır. Moksifloksasinin ile ilgili başarılı sonuçlar bildirmişlerdir. Görüldüğü üzere alternatif tedavi arayışları her geçen gün artmaktadır. SDT de ucuz ve toksik olmaması, kolay uygulanabilirliği ile Leishmaniasis’e aday olabilecek alternatif tedavi yöntemlerinden biridir.

RB, yeşil ışıkla birlikte kullanımının yanı sıra ultrases ile de kombine olarak tıp alanında uygulanmaktadır. Umemura ve ark. (27) RB gibi bazı ajanların, geri dönüşü olmayan hücre hasarına neden olabilen, nekroz veya apoptozu indüklemek için hücrelerin membran yapısını ve fonksiyonel özelliklerini değiştirebilen gaz kabarcıklarının oluşumu ve salınımı olarak tanımlanan ultrasonik kavitasyonu indükleyebildiğini bulmuştur. Bu nedenle, derin tümör hücreleri üzerinde ultrases ile aktifleştirilmiş RB’nin sonodinamik etkisini araştırmışlardır. Işığa duyarlılaştırıcılardan olan hematoporfirinler ve ksanten boyalarının, ultrasesin anti-tümör etkisini artırabildiğini ve tümörlerin tedavisi için yeni bir modalite yani SDT’yi önerdiklerini bildirmişlerdir (27). Ayrıca, Sugita ve ark.’nın (31) yaptığı bir çalışmada sarkom hücreleri üzerine RB’nin ultrases ile birlikte uygulanması, sadece ultrases uygulanan hücreler ile karşılaştırıldığında, RB ve türevleri aracılı ultrasesin sarkom 180 hücrelerinde artan in vitro hücre hasarını indüklediği gösterilmiştir

SDT üzerine rapor edilen çalışmaların çoğu kanser tedavisine odaklanmıştır (13,32,33). Bununla birlikte 2009 yılında SDT’nin antibakteriyel etkinliğe sahip olabileceği hipotezi ortaya atılmıştır (34). Sonodinamik tedavinin in vitro antibakteriyel etki için ilk kullanımı 2011 yılında Liu ve ark. (35) tarafından Escherichia coli (E. coli) üzerinde gösterilmiştir. Sonosensitizer özelliğe sahip bir antibiyotik olan florokinolon ve 40 kHz ultrasesin E. coli üzerine birlikte uygulanmasının, ilacın kendisinden daha iyi bir terapötik aktivite gösterdiği bildirilmiştir (35). Pourhajibagher ve ark.’nın (36) S. mutans üzerinde Kurkumin aracılı SDT’nin etkisini inceledikleri çalışmada 1 MHz 1,56 W/cm² yoğunluklu 1 dk ultrases uygulamasının bakteri canlılığında azalma meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Bunun yanında, Zhang ve ark.’nın (37) Porphyromonas gingivalis üzerinde HMME aracılı SDT’yi araştırdıkları çalışmada, 40 g/mL sonosensitizer uygulamasının ardından 10 dakika 1 MHz 3 W/cm² yoğunluklu ultrases uygulamasının ROS üretiminde artışa neden olduğu, bakteri sayısında ise azalma meydana geldiğini göstermişlerdir. Li ve ark. (38) bir antibiyotik olan levofloksasini bir nano partikülle konjuge ederek Mycobacterium smegmatis ve E.coli üzerinde yaptıkları SDT çalışmasında 0,67 W/cm² yoğunlukta ve 42 kHz frekansta ultrason uyarımının bakteriyel enfeksiyonu in vitro ve in vivo olarak etkili bir şekilde ortadan kaldırdığını bildirilmiştir. Şimdiye kadar yapılan antibakteriyel SDT çalışmalarının çoğu in vitro ve in vivo olarak bakterilerin öldürülmesi ile ilgiliyken, SDT ile mantar ve mayaların inaktivasyonu hakkında sadece iki çalışma rapor edilmiştir (39,40). Ayrıca virüsler üzerinde henüz SDT çalışmaları bulunmamaktadır.

Literatürde leishmaniasis üzerine SDT çalışmaları bulunamadığından paraziter organizmaya en yakın olan bakteri hücresinde yapılan ultrases çalışmaları referans alınarak ultrases optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Nakonechny ve ark.’nın (41) RB’nin E. coli ve Staphylococcus aureus (S. aureus) üzerindeki sonodinamik etkisini inceledikleri çalışmada E. coli üzerine 15 µM RB, 1-2 saat boyunca 28 kHz frekansta ve 0,5 W/cm² yoğunluklu ultrases uygulamasının ardından, bakterilerin kontrole kıyasla inhibe olduğunu bildirmişlerdir. S. aureus’ların ise SDT’ye E. coli’den daha duyarlı olduğunu ve 5 µM RB aracılı ultrasesin kontrole kıyasla azaldığını göstermişlerdir (41). Alves ve ark. (40) Candida albicans üzerinde RB aracılı ultrases (1 MHz frekansta, 2,5 W/cm² yoğunlukta, 5 dakika) uygulaması ile bakterilerin proliferasyonunu önemli ölçüde azaldığını bildirmişlerdir. Costley ve ark. (42) RB aracılı SDT’nin etkinliğini daha da artırmak için RB’yi antimikrobiyal peptit ile konjuge etmişlerdir. Konjugat ile tedavi ve ardından 1 MHz frekansta, 3 W/cm² yoğunlukta, 10 dakika ultrases uygulaması ile sırasıyla S. aureus ve P. aeruginosa planktonik kültürlerinin sayısında azalma ile sonuçlandığını bildirmişlerdir. Çalışmanın in vivo sonuçları ise, farelerde konjugatla tedavi edilen P. aeruginosa ile enfekte olmuş yaraların ultrason uygulaması ile önemli bir bakteriyel eradikasyona neden olduğunu göstermiştir (42). Bu çalışmada ise yaptığımız optimizasyon denemeleri sonucunda 10 dk boyunca 1 MHz frekansta, 1 1,5 ve 2 W/cm² yoğunluklu sadece ultrases uygulamasının L. tropica promastigotları üzerinde termal veya sitotoksik etki göstermediği tespit edilmiştir. L. tropica promastigotları için sitotoksik olmayan ultrases uygulama zamanı 10 dk olarak belirlenmiştir. Parazitler üzerine tek başına 80 40 20 µM RB uygulamasının sitotoksik etkiye yol açmadığı, 80 µM RB ile 2 W/cm² yoğunluklu ultrases birlikte kullanıldığında kontrol grubuna göre hücre sayısında azalma meydana geldiği gözlemlenmiştir. Morfolojik olarak da bu grupta atipik özellikli parazit formlarına rastlanmıştır.

Ultrases, sonosensitizer ve oksijen dahil olmak üzere üç temel bileşen, birlikte sonodinamik “öldürme etkisi” işleminin sonucunu etkiler. Bunların her biri farklı derecelerde düzenlenebilir, ultrases genellikle kontrol edilmesi en kolay ve oksijenin belirlenmesi en zor olan parametredir. Bu arada, sonosensitizer, tedavinin etkinliğini, seçiciliğini ve güvenliğini artırabileceğinden, sonodinamik stratejinin başarısını en üst düzeye çıkarmada çok önemli bir rol oynar (43). Güç, frekans, yoğunluk ve ultrason basıncı gibi SDT ile ilgili parametreler için tek tip bir standardizasyon geliştirilmelidir. Bu sorunların çözümü, SDT’de klinik dönüşümü hızlandıracaktır. Akustik parametrenin belirlenmesi ultrasesin dozu, sonosensitizerin etkinliği ve lezyonun pozisyonu ile ilgili olduğu çalışmalarda bildirilmiştir (44).

SDT terapötik açıdan faydalı bir strateji olarak büyük bir potansiyele sahip görünmektedir. Ancak incelenen antibakteriyel SDT çalışmaları kendi arasında farklılık gösterdiğinden, verilerin karşılaştırılmasını ve rasyonelleştirilmesini belirsiz kılmaktadır. Aynı zamanda, ultrases dozunda standardizasyon eksikliği ve SDT’nin mekanizmalarının kurulmasını sınırlandırmaktadır. SDT de yer alan baskın mekanizmalar muhtemelen ultrases parametrelerine, biyolojik sisteme ve sonosensitizerlerin fizikokimyasal özelliklerine bağlıdır. Ayrıca, frekans ve enerji gibi optimal parametreleri belirlemek ve optimum SDT stratejisini oluşturmak için aynı koşullar altında çok sayıda deney yapılmalıdır.

Bu sınırlamalara ek olarak, mevcut sonosensitizerler, düşük özgüllük, hızlı agregasyon ve potansiyel toksisite nedeniyle SDT’nin etkinliğini sınırlar. Mükemmel hedef özgüllüğü ve biyouyumluluğu olan yeni nano-sonosensitizerler geliştirmek için önemli çabalar sarf edilmesine rağmen, normal dokular üzerindeki yan etkiler, karmaşık hazırlama yaklaşımları ve hedef bölgede optimal olmayan birikim dahil olmak üzere çeşitli zorlukların ele alınması gerekmektedir. Bu nedenle odak noktası, gelişmiş hedef özgüllüğü, biyouyumluluk, biyogüvenlik ve terapötik etkinliğe sahip sonosensitizerler geliştirmektir. Ayrıca bu çalışmanın bir diğer sınırlaması ise L. tropica promastigotlarına karşı RB aracılı SDT’nin in vitro tabanlı bir tasarım olmasıdır. Bu analizlerden elde edilen sonuçlar bazı sınırlamalar ışığında değerlendirilmelidir. Sınırlamalar, hücre içi amastigotların veya deneysel hayvan modellerinin olmamasıyla ilgilidir. Ancak, çalışmamızın bazı güçlü yönleri de vardır. Ultrases uygulama optimizasyonu ile literatüre önemli bir katkı sağlanacaktır. Parazitler üzerine yapılan RB aracılı SDT ile ilgili çalışmalar değerli bilgiler sunmaktadır.

SONUÇ

L. tropica promastigotları üzerinde RB aracılı SDT’nin mekanizmaları ve güvenilirliğini keşfetmek, RB’nin tüm özelliklerini ve avantajlarını kullanmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç olduğuna inanıyoruz. Çeşitli alanlarda elde edilen umut verici sonuçlar ve RB aracılı SDT’nin sunduğu ilginç bakış açıları nedeniyle, gelecekte RB aracılı SDT’nin biyomedikal uygulamalarda kullanımına odaklanacak daha fazla çalışma olacağını öngörüyoruz.

*Etik

Etik Kurul Onayı: İn vitro ortamda parazit hücreleri ile çalışıldığından dolayı etik kurul onayına gerek duyulmadı.

Hasta Onayı: İhtiyaç duyulmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulunda olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

*Yazarlık Katkıları

Konsept: S.Ö.Ç., C.A., Ö.F.D., İ.K., H.Ö., Dizayn: S.Ö.Ç., C.A., Ö.F.D., Veri Toplama veya İşleme: S.Ö.Ç., C.A., İ.K., H.Ö., Analiz veya Yorumlama: S.Ö.Ç., C.A., Literatür Arama: S.Ö.Ç., C.A., Ö.F.D., İ.K., H.Ö., Yazan: S.Ö.Ç., C.A.

Çıkar Çatışması: Yazarlar çıkar çatışması bildirmemişlerdir.

Finansal Destek: TUBİTAK 2209-A Üniversite Öğrencileri Araştırma Projeleri’nden maddi, Prof. Dr. Hatice Ertabaklar’dan ise materyal destek alınmıştır.