GİRİŞ
Taeniidae ailesine ait küçük bir sestod olan Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis’in sebep olduğu kistik ve alveolar ekinokokkoz insanlarda oldukça yaygın görülmesine rağmen, Echinococcus oligarthrus ve Echinococcus vogeli’ye bağlı hastalıklar daha çok Orta ve Güney Amerika ile sınırlıdır (1-7). Echinococcus türleri insanlarda ciddi ve hatta ölümcül olabilen hastalık oluşturabilirken, hayvanlarda da çeşitli organ ve dokularda yapısal ve fonksiyonel bozukluklar oluşturarak ekonomik kayıplara neden olmaktadır (2,4).
Etiyolojisi bulunduğumuz yüzyıla kadar belirsiz kalan bu parazite dönük morfolojik çalışmalar, taksonomik revizyonlar, suş tanımlaması ve moleküler çalışmalar aşamalı olarak cins içindeki çeşitliliğini anlamamızı sağlamıştır (1-5). Mitokondriyal DNA sekansları neticesinde E. granulosus’un on farklı genetik yapısı (G1-10 genotipleri) tanımlanmıştır (1-6). Echinococcus suş ve türlerinin moleküler olarak tanımlanmasında hem taze hem de formalin fikse parafine gömülü (FFPG) örneklerden yararlanılmaktadır (1-11).
E. granulosus’un etkeni olduğu kist hidatik hastalığı ülkemizde de endemiktir (2,4,5,9,10). Moleküler çalışmalar Türkiye’deki insanlarda ve hayvanlarda E. granulosus sensu stricto’nun (G1-G3) baskın ve en yaygın suş olduğu göstermektedir (2,4,5,9,10,12-15). İnsanlarda en yüksek kist hidatik prevalansının koyun yetiştiriciliği yapılan toplumlarda bulunması nedeniyle köpek-koyun döngüsü ve E. granulosus’un koyun suşu halk sağlığı açısından oldukça önemlidir (2,4,5) ancak bu kapsamda daha önce Çorum ve yöresinde yapılmış bir araştırma bulunmamaktadır.
Bu çalışmanın amacı, Çorum ilinde cerrahi operasyon ile insanlardan elde edilen, FFPG kist örneklerini retrospektif olarak değerlendirmek, Echinococcus spp. varlığını moleküler olarak tespit etmek ve FFPG arşiv örneklerinde karşılaşılan DNA izolasyon problemlerini tartışmaktır.
YÖNTEMLER
Örneklerin Seçimi
Bu çalışmada, 01.01.2011 ve 01.12.2018 yılları arasında Hitit Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı’nda histopatolojik olarak “kist hidatik” tanısı almış 47 hastanın biyopsi raporları ve FFPG arşiv preparatları retrospektif olarak değerlendirildi. Eksize edilmiş dokuların mikroskopik incelemesinde (PAS pozitif lamine tabakalar ve/veya protosklekslerin ve/veya kanca parçalarının saptanması) 47 hastanın tamamının kistik ekinokokkoz ile enfekte olduğu belirlendi. Etik kurul onayı Hitit Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan alındı (2018-21).
Deparafinizasyon
FFPG örneklerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için ayrı mikrotom bıçakları kullanıldı, mikrotom aleti ve çevresindeki yüzey her kesitten sonra RNAase ZAP ile temizlendi ve daha sonra damıtılmış suyla yıkanarak kurulandı. Çalışma tezgahı, reaktiflerin ve numunelerin hazırlanacağı yüzey plastikle desteklenmiş emici laboratuvar tezgah örtüleri ile kaplandı.
Her olgu için FFPG bloklarından iki adet 10 mikrometre kalınlıkta en az 20 adet seri kesit hazırlandı. Kesitler 1,5 mL’lik mikrotüplere yerleştirildi ve 1 mL’lik ksilen ile 37 °C’de 3 kez 10 dakika süreyle deparafinize edildi. Daha sonra alkol ile muamele edilen (sırası ile %100’lük, %90’lık, %80’lik, %70’lik, %60’lık ve %50’lik) örnekler 1,500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilerek süpernatan çıkarıldı ve bu işlem bir kez tekrarlandı. Elde edilen örnekler 1 mL H2O içerisinde 4 ºC’de saklandı ve bistürü yardımı ile cam petri üzerinde mekanik parçalandı ve üzerine 400 µL ATL Buffer ve 60 µL proteinaz K eklenip 56 ºC’de 48 saat boyunca inkübasyona bırakıldı. Her 8 saatte bir 10 µL proteinaz K eklenip karıştırıldı, 48 saat tamamlanınca 90 ºC’de 1 saat inkübe edildi, ardından 200 µL Buffer AL ve 200 µL etanol eklendi. Tüplere aktarılan örnekler 6,000 rpm’de santrifüjlendi. 500 µL Buffer AW1 (yıkama tamponu) eklenip 6,000 rpm’de tekrar santrifüj yapılıp filtreden sızan sıvı atıldı, bu işlem 500 µL Buffer AW2 (yıkama tamponu) eklenip tekrarlandı. Membranı tam kurutmak için ilaveten 3 dk 14.000 rpm’de santrifüjlenip sızan sıvı atıldı, filtreli tüpe 80 µL AE ayrıştırma solüsyonu (10 mM Tris CI, 0,5 mM EDTA, pH 9,0) konulup 1 dakika oda ısısında bekletildi, 8,000 rpm’de santrifüjlenerek DNA ekstraksiyon işlemi tamamlandı. Mikrosantrifüj tüpünde kalan DNA miktarı spektrofotometrede ölçüldü ve %1,5 etidyum bromid eklenerek hazırlanan agaroza 10 µL yüklenerek, 110 voltta 45 dakika olacak şekilde elektroforez işlemine tabi tutularak görüntülendi.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) için özetle Tablo 1’de gösterilen primer çiftleri kullanıldı ve reaksiyon karışımı Tablo 2’deki gibi hazırlandı (2,4,5). Örnek sayısına göre (n=47) hazırlanan karışımdan PZR tüplerine 45 µL olacak şekilde paylaştırıldı, daha sonra karışıma 5’er µL DNA örneği konulup, reaksiyon için ısı döngü cihazına yerleştirildi (2,5).
%1,5 etidyum bromid eklenerek hazırlanan agaroza PZR’de çoğaltılan DNA örneklerinden 10 µL ve standart bir DNA merdiveni (Bio-Rad) yüklenerek, 110 voltta 45 dakika olacak şekilde elektroforez işlemine tabi tutuldu.
İstatistiksel Analiz
Çalışmanın tüm istatistiksel analizi IBM SPSS Statistics for Windows, Version 26.0 (IBM Corp.; Armonk, NY, USA) kullanılarak yapıldı. Verilerin betimsel istatistik değerleri incelendi. Bu kapsamda frekans, ortalama, standart sapma değerlerine bakıldı. Grupların homojen dağılıp dağılmadığını tespit etmek için normalite testi yapıldı. Homojen dağılım göstermeyen gruplarda ise bağımsız kategorik değişkenler Pearson ki-kare testi ve Fisher’in kesin ki-kare testi ile karşılaştırıldı, p<0,05 anlamlı olarak kabul edildi.
BULGULAR
Histolojik Bulgular
Hitit Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı Arşivi'nin 01.01.2011 ve 01.12.2018 tarihleri arasında retrospektif olarak incelenmesiyle “kist hidatik” tanısı almış 47 hastaya ait FFPG örnekleri çalışmaya dahil edilmiştir (Tablo 3).
Olgulara ait FFPG bloklardan elde edilen kesitler tekrar hematoksilen & eozin (H&E) ile boyanarak incelenmiştir. Mikroskopik incelemede bazı örneklerin kist duvarlarının dış kısmının aselüler laminer tabakadan ve iç kısmının da germinal tabakadan oluştuğu görülmüştür (Şekil 1). Yerleştiği organa ait stromal veya parankimal doku ile çevrili laminer tabaka ve fibrozis alanları belirlenmiştir (Şekil 22). Bazı olgularda kist duvarı fibrohiyalinize, dejenere olmuş ve germinal tabakası kaybolmuş (Şekil 3) iken olguların bazılarında ise fokal alanlarda kız kistleri (Şekil 4) saptanmıştır.
İncelenen Olguların Genel Özellikleri ve Dağılımları
“Kist hidatik” tanısı almış 47 hastanın 26’sı (%55,3) kadın, 21’i (%44,7) erkektir. Olguların 5’i (%10,6) çocukluk çağındadır. Olguların yaşları dokuz ila 82 arasında olup ortalama yaş 45,47’dir (Tablo 3).
Karaciğer tutulumu olan olgu sayısı 32 (%68,1), akciğer sekiz (%17,0), batın içi altı (%12,8) ve beyin birdir (%2,1). Kist çapları olguların beşinde (%10,6) <5 cm, 29’unda (%61,7) 5-10 cm arasında ve 13’ünde (%27,7) >10 cm’dir. Olguların 28’inde (%59,6) multipl, 19’unda (%40,4) tek lezyon bulunmaktadır.
H&E boyalı histolojik kesitlerin %14,9’unda (7/47) skoleks mevcuttu. On dokuz (%40,43) olguya ait FFPG blokları beş yıldan daha uzun süre arşivde tutulan kist hidatik örneklerini içermekteydi.
Agaroz Jel Elektroforez ve PZR Sonuçları
İncelenen 47 örneğin sadece 11’inde (%23,4) DNA bantları görüntülendi (Şekil 5). DNA tespit edilen 11 olguda skoleks bulunan yedi (%63,6) ve bulunmayan dört (%36,4) olgudan oluşan iki grup Fisher’in kesin ki-kare testi ile karşılaştırıldı ve gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,00). DNA tespit edilen olgularda cinsiyete, lezyonların lokalizasyonlarına, yıllara, lezyonların tek/multipl olmasına, boyutlarına, hastaların yaşlarına göre istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (Tablo 3).
Parazite özgü DNA elde edilmesi ve PZR için farklı iki merkezde (Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı ve Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı) farklı primer çiftleri kullanılarak analizler tekrarlandı ancak PZR ürünlerinde çoğalma olmadı.
TARTIŞMA
Az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde yaygın olarak tespit edilen kistik ekinokokkoz ülkemizde ve dünyada ekonomik kayıplara neden olan önemli bir halk sağlığı sorunudur (2,4,5,16). E. granulosus’un koyun suşu (G1 genotipi) dünya çapında en yaygındır. Birçok çalışma, G1’in Türkiye’de baskın izolat olduğunu, insan ve hayvan kistik ekinokokkozunda ana ajan olduğunu göstermiştir (2,4,5,9,12-14,17). Çorum ilindeki ekinokok suşları/türleri ise belirsizdir.
Kistik ekinokokkoz prevalansının Türkiye’de yaşla birlikte giderek artmaktadır (18). Güreser ve ark.’nın (19) Çorum ilini kapsayan bir çalışmasında olguların %75’i 40 yaş üzerindedir. Beyhan ve ark.’nın (2) Van Bölgesi’ni içeren çalışmasında yaş aralığı 15-44’tür. Çalışmamızda ortalama yaş 45,47 idi.
Epidemiyolojik verilerin incelendiği Yazar ve ark. (20) çalışmasında Karadeniz Bölgesi’ndeki 428 olgunun %71,9’u kadın, %28,1’i erkek olarak ve İç Anadolu Bölgesi’nde 13 ili kapsayan Yılmaz ve Babür (21) çalışmasında kadın %56 ve erkek %44 olarak bulunmuştur. Güreser ve ark. (19) çalışmasında 148’i kadın 105’i erkek seropozitif hastaların 31’inde (%96,9) karaciğer tutulumu, bu hastaların ikisinde (%6,3) aynı zamanda akciğer tutulumu olduğu belirlenmiş, bir hastada (%3,1) ise karaciğer tutulumu olmadan sadece intraperitoneal tutulum rapor edilmiştir. Çalışmamızda hastaların 26’sı (%55,3) kadın, 21’i (%44,7) erkekti ve karaciğer yerleşimli %68, akciğer %17, batın içinde %13 ve beyin %0,2 oranında gözlendi.
DNA analizlerini içeren birçok kriter Echinococcus organizmalarını karakterize etmek için kullanılmıştır (13). Direkt olarak parazit genomunu inceleyen DNA esaslı yöntemler ile genetik varyasyon mitokondriyal veya nükleer genomda araştırılabilir (2,5,13). Çalışmamızda saklanması ve taşıması kolay olan FFPG örnekleri ekinokok gibi bulaşıcı hastalıklar, kanser hastalıkları ve moleküler/genetik çalışmalar için temel bir kaynak oluşturmaktadır (1,4,5,12-14,22,23).
Simsek ve ark. (23) çalışmasında, E. granulosus’a özgü DNA’yı 70 FFPG doku örneğinin 29’unda (%41,4) çoğaltılabilmiş ve 41’inde (%58,6) DNA tespit edilememiştir. Schneider ve ark. (1) insan FFPG örneklerde Echinococcus genotipleri/türlerine ilişkin çalışmasında, PZR amplifikasyonu toplam blokların %85’inde başarılı olmuştur. Ülkemizde PZR amplifikasyonu Simsek ve ark. (23) çalışmasında %41,6 (29/70), Kurt ve ark. (4) çalışmasında ise %82,6 (19/23) oranına başarılı olmuştur. Retrospektif olan çalışmamızda FFPG hidatik kist örneklerinden yalnızca 11’inde DNA saptanmıştır. Çalışmamızda hem DNA izolasyonu hem de PZR adımlarında negatif sonuçların üstesinden gelmek için toplam 47 örnek farklı primer çiftleri (Tablo 1) kullanılarak farklı iki merkezde iki kez analiz edilmiş fakat başarılı olunamamıştır.
FFPG örneklerinden elde edilen DNA’lar ile yapılan moleküler testler genellikle problemli olmaktadır (1,4,22,24). FFPG örneklerinde DNA elde edilememesinin olası nedenleri vardır. Kist örneklerinde germinal merkez tabakasının yeterli olmaması, yeterli protoskoleks içermemesi, formaldehit kaynaklı DNA hasarları, dokuları sert ve mekanik kesme nedeniyle DNA’nın bozulması başlıca nedenler olarak açıklanmaktadır (1,2,4,5,12-14,22,24,25). Çalışmamızda, dokular 20 mikron kalınlığında ve mikrotom cihazı kullanılarak kesilmiştir. DNA tespit edilen olgularda skoleks bulunan ve bulunmayan iki grup karşılaştırıldığında gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p=0,00). Çalışmamızda kullandığımız arşiv örneklerinin yeterli oranda skoleks ve/veya germinal membran içermemesi ile birlikte kist duvarı çevresinde yaygın fibrozis, enflamatuvar reaksiyon ve stromal veya parankimal doku varlığı (Şekil 2, 3, 4) Echinococcus spp. izolasyonunda olumsuz rol oynayan faktörler olarak düşünülmüştür.
Özellikle, DNA’nın fragmantasyonu, PZR amplifikasyonunda mevcut amplifiye edilebilir kalıpların miktarını önemli ölçüde azaltan en sık DNA hasar şeklidir (1,4,5,22,24,25). Uzun DNA fragmanlarının (200/300 bp’den uzun) amplifiye edilmesinde formaldehit fiksasyonu olumsuz bir etkiye sahiptir (26). Formaldehit DNA bazlarının imino grupları ile reaksiyona girerek DNA’yı çapraz bağlar. Formaldehit kaynaklı DNA çapraz bağları çift sarmallı DNA’nın stabilitesini azaltır ve bu da DNA’nın kısmi denatürasyonuna neden olur (22,26). Formaldehit ayrıca DNA’da “abazik” alanlar oluşturur. Tamponlanmamış formaldehit fiksasyonu, çoğaltılabilir DNA kalıplarının miktarını önemli ölçüde azaltmakta, abazik bölgeler sekans artefaktlarına ve sekans analizinde problemlere yol açmaktadır (22). Tek bir bazda dahi hasar, polimeraz uzamasını bloke ederse bir kalıbı etkili bir şekilde yok edebilmektedir. Bununla birlikte, özellikle hasarın kalıplar arasında rastgele dağılması veya farklı olması nedeniyle formaldehit fiksasyonunun neden olduğu hasar tiplerini karakterize etmek de zordur (24). Urasil lezyonları da FFPG dokuların DNA’sındaki ana dizi artefaktları olarak tanımlanmıştır. Formaldehit fiksasyon süresi ve fiksatif seçimi, ekstrakte edilen DNA’nın kalitesini önemli ölçüde etkilemektedir. PZR’nin beş yılı geçmemiş FFPG örneklerde daha duyarlı olduğu belirtilmektedir (1). Taze formaldehitle fikse dokulardan alınan DNA ile karşılaştırıldığında, daha uzun süre formaldehitle fikse dokulardan alınan DNA başarı oranının azaldığı gösterilmiştir. Arşiv bloklarında DNA fragmantasyonunun sürekli olarak meydana gelebildiği anlaşılmıştır (27). Negatif sonuçların bir başka nedeni, kist dokularının germinal/laminer tabakalarının yüksek polisakkarit içeriği ile PZR’yi inhibisyonu olabileceğidir. Fakat inhibitörlerin çıkarılması için önerilen yöntemler FFPG dokularına uygulanamamıştır (1). Çalışmamızda kullanılan FFPG örnekleri patoloji arşivinden elde edilmiştir. Beş yıldan uzun süredir bekleyen FFPG örnek sayısı 19’dur (%40). Bu örneklerde fiksasyon süresi, sıcaklık ve çeşitli fiksatiflerin kullanımı için geriye dönük kontrolü ise imkansızdı. Kısa bir fragmanı çoğaltmak için primerler kullanmamıza rağmen DNA izolasyonu gerçekleşmemiştir.
Kist hidatikde, suş ve tür tayininde, herhangi bir fiksatife konulmadan canlı kist sıvısı ve germinal tabaka içeren kist duvarı örnekleri tercih edilen materyallerdir (2,11). Beyhan ve ark. (2) çalışmasında ameliyatta elde edilen kistler parazitoloji laboratuvarına hemen transfer edilmiş ve DNA ekstraksiyonuna kadar -20 °C’de dondurularak korunmuştur. Erdoğan (28), Hamamcı (29), Gökpınar (30) ve ark. çalışmalarında taze kist sıvısındaki protoskolekslerden genomik DNA izolasyonunun ve PZR aşamalarının sorunsuz olarak yapıldığı belirtilmektedir. Quach ve ark. (24) çalışmasında taze dokudan elde edilen DNA’da, ölçülebilir DNA hasarının olmadığı görülmüştür.
SONUÇ
Çalışmamızda Çorum ilinde histopatolojik olarak pozitif bulunan 46 örneğin 11’inde (%23) Echinococcus spp.’ye ait DNA bantları görüntülenerek tanıları konfirme edilmiş oldu. Ancak muhtemelen örneklerin arşiv FFPG olması ve uzun süre formaldehitte kalmasına bağlı olarak DNA saptanan örneklerde iki farklı merkezde çalışılmasına karşın PZR ve genotiplendirme başarılı olamadı. Bu kapsamda ileride ekinokokkozla ilgili moleküler çalışma yapmayı planlayan araştırıcıların tercihen taze örneklerden çalışması ve bu mümkün değilse formaldehitte uzun süre bekletmeden, germinal merkezleri ile birlikte skolekslerini koruyarak saklanması önerilir. Çorum’daki Echinococcus suşlarının operasyon sonrası taze olarak alınan kistlerden daha geniş kapsamlı bir çalışmayla değerlendirilmesi planlanmaktadır.
*Etik
Etik Kurul Onayı: Hitit Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan alındı (2018-21).
Hasta Onayı: Retrospektif plananlanan bir çalışma olduğu için alınmamıştır.
Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulundaki kişiler tarafından değerlendirilmiştir.
* Yazarlık Katkıları
Konsept: Y.B., A.T.Ö., Dizayn: Y.B., Y.E.B., T.Ö., Veri Toplanma veya İşleme: Y.B., Y.E.B, H.H.K.Ş, Analiz veya Yorumlama: Y.E.B., Y.B., A.T.Ö., H.H.K.Ş., Literatür Araması: A.S.G., D.K., G.G., T.Ö., Yazan: Y.B., A.T.Ö.
Çıkar Çatışması: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemişlerdir.
Finansal Destek: Hitit Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projesi tarafından desteklenmiştir (proje no: TIP19001.18.002).