ÖZET

Amaç:

Bu çalışmada, Toxoplasma gondii (T. gondii) ile enfekte hastalardan alınan serum örneklerinde anti-T. gondii antikor titrelerinin sıcaklık ve zamana bağlı değişiminin belirlenmesi amaçlanmıştır.

Yöntemler:

Mayıs 2017 ile Şubat 2018 tarihleri arasında Manisa Celal Bayar Üniversitesi Hafsa Sultan Hastanesi Parazitoloji Polikliğinimize başvuran T. gondii ile enfekte 18 yaş ve üstü gebe veya gebe olmayan beş gönüllü kadının beş farklı koşulda (oda, kargo paketi, buzdolabı, derin dondurucu, etüv) saklanan serum örneklerinde anti-T. gondii IgG antikor düzeyleri enzim bağlantılı floresan testi (ELFA) ile çalışılmıştır.

Bulgular:

T. gondii ile enfekte beş gönüllü kadının oda sıcaklığı (20/25 °C), kargo paketi (+4/+8 °C), buzdolabı (+4 °C), derin dondurucu (-16/-20 °C) ve etüvde (+37 °C) saklanan serum örnekleri 0, 24, 48. ve 72. saatlerde ELFA testi ile çalışıldığında anti-T. gondii IgG antikor titrelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim bulunmamıştır (p>0,05).

Sonuç:

T. gondii ile enfekte hastalardan alınan serum örneklerinin laboratuvarda çalışılmak üzere, farklı ortam sıcaklıklarında ve 72 saate kadar olmak üzere farklı sürelerde ulaştırılması durumlarında elde edilen test sonuçlarının klinik olarak anlamlı düzeyde etkilenmediği saptanmıştır. Örnek sayısı artırılarak ve serum örneklerinin 72 saatten daha uzun süre saklanarak değerlendirilmesi ile, daha geniş kapsamlı araştırma verilerine ulaşılabileceği kanaatine varılmıştır.

GİRİŞ

Toxoplasmosis, zorunlu hücre içi paraziti olarak yaşayan Toxoplasma gondii’nin (T. gondii) tüm memelilerde ve kuşlarda yol açtığı hastalıktır (1). T. gondii’nin kesin konağı kedi ve kedigiller, ara konağı ise insan dahil tüm omurgalı hayvanlardır (2). T. gondii insana, kedi ve kedigillerin ookistli dışkısı ile temas eden besin ürünleriyle, kist formu taşıyan çiğ ya da az pişmiş et ürünleriyle, kan transfüzyonuyla, organ nakliyle ve transplasental yolla bulaşmaktadır (3). Dünya genelinde yürütülen çalışmalarda, nüfusun yaklaşık üçte birinin T. gondii ile enfekte olduğu bildirmektedir (4). Toxoplasmosisin klinik belirtileri asemptomatik bulgulardan hayati tehdit eden durumlara yol açabilmektedir (5). İnsanlarda bebek kaybı, hasta bebek doğumu, ölü doğum, görme bozuklukları, ensefalit ve hatta ölümle bile sonuçlanan hastalık oluşturmaktadır (1).

Hastalardan kan örneklerinin alınması ve laboratuvara ulaşması sürecinde bazı aksaklıklar çıkabilmektedir. Hastaya ait kan tüplerinin unutulması, serum örneklerinin farklı sıcaklıklarda uzun süre beklemesi ya da bir ilden başka bir ilin laboratuvarına gönderilen serum örneklerinin uzun süre farklı sıcaklıklara maruz kalması gibi aksaklıklar yapılan tahlil sonuçlarının doğruluğunu etkiler mi sorusunu akla getirmektedir. Farklı sıcaklık ve zamanlarda saklanan serum örneklerindeki IgG antikor seviyesindeki değişimler T. gondii’li hastaların serum örneklerinin saklanması için en uygun ortam, sıcaklık ve zamanın nasıl olması gerektiği açısından önem taşımaktadır.

Birçok çalışmada enzim bağlantılı floresan testiyle (ELFA) T. gondii seroprevalansı araştırılmıştır (6-8). Fakat serum örneklerinin çevre koşullarından etkilenmesinin test sonuçları üzerinde nasıl bir değişime yol açabileceği üzerinde çok az sayıda çalışma bulunmaktadır (7). Bu çalışmada T. gondii ile enfekte hastalardan alınan serum örneklerindeki anti-T. gondii antikor titrelerinin sıcaklık ve zamana bağlı değişiminin saptanması amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Araştırma öncesinde Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Sağlık Bilimleri Etik Kurulu’ndan 10.05.2017-20478486 tarih ve sayılı etik kurul onayı alınmıştır. Araştırmaya katılmak isteyen gönüllü katılımcılardan hasta onamı bilgilendirilmiş gönüllü onam formu imzalatılarak alınmıştır. Çalışma kapsamında Mayıs 2017-Şubat 2018 tarihleri arasında Manisa Celal Bayar Üniversitesi Hafsa Sultan Hastanesi Parazitoloji Polikliniği’ne rutin kontrol amacıyla başvuran T. gondii ile karşılaşmış ve önceki testlerde kanında IgG antikor varlığı tespit edilmiş, gebe veya gebe olmayan, 18 yaş ve üstü beş gönüllü katılımcı öncelikle telefon ile aranarak çalışma hakkında ön bilgi verilmiş ve polikliniğimize davet edilmiştir. Gelen gönüllülere çalışma ile ilgili detaylı bilgi verilip bilgilendirilmiş gönüllü onam formu imzalatılmıştır. Gönüllü katılımcılardan alınan kan örneklerinde anti-T. gondii IgG antikorları ELFA testi ile mini VIDAS® (bioMerieux, Marcy l’Etoile, Fransa) cihazında çalışılarak araştırılmıştır.

Serum Örneklerinin Çalışma için Hazırlanması

Hasta kanları 4,000 rpm devirde 10 dk santrifüj edilerek serumları ayrıştırılmıştır. Her çalışma hastasına ait serum örneklerinin 0, 24, 48 ve 72 saat süreyle beş farklı ortam koşulunda (oda koşulları, kargo paketi, buzdolabı, derin dondurucu, etüv) muhafaza edilmesi planlanmıştır. Çalışma hastalarına ait serum örneklerinin 0. saatte çalışılması için bir adet 1,5 mL santrifüj tüpü, 24, 48. ve 72. saatlerde beş farklı ortam koşulunda serum örneklerinin saklanması için 3’er adet olmak üzere toplamda 16 adet santrifüj tüpü hazırlanmıştır. Kullanılacak tüplerin üzerine hasta isimleri ve saklama süreleri yazılmıştır. Oda koşulları (20/25 °C), kargo paketi (+4/+8 °C), buzdolabı (+4 °C), derin dondurucu (-16/-20 °C) ve etüv (+37 °C) sıcaklık koşullarının her birinin takibi için ayrı termometreler kullanılmıştır. Çalışma için mini VIDAS® cihazında kullanılacak Toxoplasma IgG kitlerindeki kuyucuklar 100 µL serum örneği alabildiği için her çalışma hastasına ait 16 adet santrifüj tüpüne eşit oranda paylaştırılacak serum örneği 2 mL olarak belirlenmiştir. Hazırlanan santrifüj tüplerine, hata payını en aza indirebilmek amacıyla 110 µL serum örneği aktarılmıştır. Her bir çalışma hastasının serum örnekleri 0. saatte çalışılmak üzere bir adet santrifüj tüpüne konulmuştur. Kalan serum örneği oda koşulları, kargo paketi, buzdolabı, derin dondurucu ve etüvde 24, 48 ve 72 saat saklanmak üzere 5’er adet 1.5 mL santrifüj tüpüne konularak saklanmıştır.

Serum Örneklerinin Çalışılması

Her bir çalışma hastasından alınan serum örneklerinin konulduğu santrifüj tüpleri, aynı gün içinde bekletilmeden 0. saatte çalışılması için hazırlanmıştır. Buzdolabı koşullarında +4 °C’de saklanan Toxoplasma IgG kitleri mini VIDAS® cihazına yerleştirilmiştir. Tüplerdeki serum örnekleri önce vorteksle karıştırılmış, sonrasında 100 µL’ye ayarlanan mikropipetle alınarak mini VIDAS® cihazına yerleştirilen kitler üzerindeki küçük kuyucukların içine aktarılmıştır. Aktarma işlemi bittikten sonra test başlatılmıştır. Bu uygulanan işlemler, oda koşulları, kargo paketi, buzdolabı, derin dondurucu ve etüvde 24, 48 ve 72 saat süreyle saklanan her hastanın serum örneklerinin Toxoplasma IgG antikor seviyelerini tespit etmek amacıyla uygulanmıştır.

Sonuçların Değerlendirilmesi

Firma önerileri doğrultusunda anti-T. gondii IgG sonuçları, pozitif: ≥8 UI/mL, şüpheli: ≥4 ve <8 UI/mL, negatif: <4 UI/mL olarak değerlendirilmiştir.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel değerlendirme için SPSS 15.0 programı kullanılmış verilerin karşılaştırılması Wilcoxon Signed Ranks test ile yapılmıştır.

BULGULAR

Manisa Celal Bayar Üniversitesi Hafsa Sultan Hastanesi Parazitoloji Polikliniği’ne rutin kontrol amacıyla başvuran beş gönüllü kadın çalışmaya dahil edilmiştir. Gönüllülerden alınan serum örnekleri bekletilmeden 0. saatte ELFA testi ile çalışılarak anti-T. gondii IgG seviyeleri belirlenmiştir. Daha sonra beş farklı ortam koşulunda (oda koşulları, kargo paketi, buzdolabı, derin dondurucu, etüv) 24, 48 ve 72 saat saklanan serum örnekleri ELFA testi ile çalışılarak anti-T. gondii IgG seviyeleri ölçülmüştür. Çalışma hastalarının 0. saatteki ölçüm sonuçları ile beş farklı ortam koşulunda (oda koşulları, kargo paketi, buzdolabı, derin dondurucu, etüv) 24, 48 ve 72 saat saklanan serum örneklerinin anti-T. gondii IgG seviyeleri Wilcoxon Signed Ranks testi ile karşılaştırılmıştır. Beş farklı ortam koşulunda 0, 24, 48 ve 72 saat saklanan serum örneklerinin anti-T. gondii IgG antikor titrelerinin karşılaştırılmasında istatistiksel olarak anlamlı bir değişim bulunmamıştır (p>0,05).

Çalışmaya katılan beş gönüllü katılımcıdan alınan serum örneklerinin ELFA testi ile çalışılması sonucunda elde edilen anti-T. gondii antikor değerleri Tablo 1’de verilmiştir.

TARTIŞMA

Dünya genelinde T. gondii seroprevalansının kutuplarda, kuru ve sıcak bölgelerde düşük, nemli ve tropik bölgelerde daha yüksek olduğu bildirilmiştir (9). T. gondii’ye Latin Amerika ve tropikal Afrika ülkelerinde yüksek oranda rastlanırken, bu oranı Orta ve Güney Avrupa ülkeleri takip etmekte ve en düşük seviye ise Kuzey Amerika ve Kuzey Avrupa ülkelerinde izlenmektedir (10). Toxoplasmosis seroprevalansı ülkemizde de birçok araştırmada yüksek oranlarda bildirilmiştir. IgG seropozitifiği oranlarına bakarsak Malatya’da %39,6 (11), Aydın’da %30 (12), Şanlıurfa’da %69,5 (3), Manisa’da 2006-2010 yıllarında Celal Bayar Üniversitesi Hafsa Sultan Hastanesi’nde yapılan çalışmada anti-T. gondii IgG %23,3 (2), Afyon’da %23,6 (13), Isparta’da %24,4 (14), İstanbul’da %29,7 (15), Muğla’da %20,6 (16), Kilis’te %63,4 (17) oranlarında saptanmıştır. Toxoplasmosis seroprevalansındaki farklı oranlarda verilerin yaşa, kişilerin temizlik alışkanlıklarına, bölgenin iklimine, coğrafi koşullara ve sosyokültürel duruma bağlı olarak değişebildiği bildirilmiştir (18). Bunların yanı sıra çalışılan test yöntemlerinin de sonuçları etkileyebileceği düşünülmektedir.

Tanıda anti-T. gondii antikorlarının saptanması için ilk tercih edilen yöntem serolojik yöntemlerdir (19). Serolojik yöntemlerle anti-T. gondii IgG ve IgM antikor seviyelerine bakılmaktadır. Enfeksiyon etkeninin alımından yaklaşık iki hafta sonra kanda IgG antikorları görülmekte, bir buçuk ile iki ay içerisinde en üst seviyeye ulaşarak ömür boyu pozitif olarak kalmaktadır (20). Bizim çalışmamızda da gönüllü katılımcıların serum örneklerinde anti-T. gondii IgG antikorları, serolojik yöntemlerden biri olarak kullanılan ELFA testi ile çalışılmıştır. Çalışmalarda ELFA testinin yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip olduğu bildirilmiştir (21,22).

Ülkemizde farklı kurumlara ait test rehberlerinde anti-Toxoplasma IgG testi için hastalardan alınan serum örneklerinin transfer ve saklama koşullarının benzer olduğu görülmüştür. Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Sağlık Hizmetleri Uygulama ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı Test Rehberi’nde anti-Toxoplasma IgG testi için jelli düz biyokimya tüpüne alınan kan örneklerinin bekletilmeden laboratuvara ulaştırılması, serum örneklerinin ise 15-30 °C’de 3 gün, 2-8 °C’de 14 gün, < (-10) °C’de 2 ay saklanması uygun görülmüştür (23). Şanlıurfa Halk Sağlığı Laboratuvarı Tıbbi Tahlil Laboratuvarları Test Rehberi’nde kan örneklerinin jelli düz biyokimya tüpüyle hemen laboratuvara ulaştırılması ve serum örneklerinin 2-8 °C’de 14 gün saklanması önerilmiştir (24). Sağlık Bilimleri Üniversitesi Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı Test Rehberi’nde Toxoplasma IgG testi için serum örneklerinin sarı kapaklı tüpe alınması, oda sıcaklığında transfer edilip 2-8 °C’de saklanması (25), Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Laboratuvarı’nda ise serum örneklerinin 2-8 °C’de 7 gün, saklama koşullarımızdan biri olan -20 °C’de daha uzun süre saklanması (26) uygun görülmüştür. Patnos Devlet Hastanesi'nde uygulanan Mikrobiyoloji Laboratuvarı Test Rehberi’nde ise kan örneklerinin sarı kapaklı kan tüpü ile maksimum 15 dakikayı geçmeden laboratuvara ulaştırılıp 20-25 dakika kadar oda ısısında bekletildikten sonra santrifüj edilmesi ve laboratuvarda hemen çalışılmayacak serum örneklerinin santrifüj tüplerine aktarılarak saklama koşullarımızdan biri olan -20 °C’de, 2 aydan daha uzun süre bekleyecek örneklerin ise -86 °C’de saklanması önerilmiştir (27). Çalışmamız ise serum örneklerinin naklinin ve saklanmasının farklı sıcaklık ve ortam koşullarında 72 saate kadar uygun olduğunu göstermiştir.

Fransa’da yapılan bir araştırmada serum örneklerini uzun süre depolamanın toxoplasmosis serolojik değerlerinin yorumunu nasıl değiştirebileceği araştırılmış ve serum örneklerinin en az altı yıl -20 °C derin dondurucuda saklamanın sonuçların değerlendirilmesinde değişikliğe neden olmadığı bildirilmiştir (7). Bizim araştırmamızda ise serum örneklerinin beş farklı ortam koşulunda 24, 48 ve 72 saat saklanıldığında anti-T. gondii IgG değerlerindeki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0,05).

Endonezya’da yapılan bir seroprevalans araştırmasında kan örneklerinin transportu termik çanta (2-8 °C) ile sağlanmış, ardından buzdolabında (+4 °C) gece boyunca bekletilmiş ve ayrılan serum örnekleri santrifüj tüplerine aktarılarak derin dondurucuda (-20 °C) saklanmıştır. Bu saklama koşullarındaki serum örneklerinin anti-T. gondii IgG antikorları değerlendirilmiştir (28). Bizim çalışmamızda ise serum örnekleri kargo (4-8 °C) ile nakil için köpük kutu tercih edilerek sonuçlar değerlendirilmiştir.

Çalışmamızda T. gondii ile enfekte gönüllü beş kadın hastadan alınan serum örnekleri oda koşullarında (20/25 °C), kargo paketinde (+4/+8 °C) , buzdolabında (+4 °C), derin dondurucuda (-16/-20 °C) ve etüvde (+37 °C) 0, 24, 48 ve 72 saat saklanarak ELFA testiyle yapılan değerlendirmede, anti-T. gondii antikor titrelerinde istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmamıştır. Aynı zamanda anti-T. gondii IgG antikor seviyelerinde pozitiflik kriterinin etkilenmediği görülmüştür.

Çalışmanın Sınırlılıkları

Bütçe desteği olmaması sebebiyle araştırmamıza dahil edilen hasta sayısının ancak beş kişi ve çalışma süresinin 72 saat ile kısıtlı olması, sadece IgG antikor titrelerinin değerlendirilmesi, ayrıca IgM antikor titrelerinin değerlendirilememesidir. Hasta sayısın artırılması ve serum örneklerin 72 saatten daha uzun süre saklanarak değerlendirilmesi ile daha geniş kapsamlı araştırma verilerine ulaşılabileceği kanaatine varılmıştır.

SONUÇ

Serum örneklerindeki anti-T. gondii antikor titrelerinin sıcaklık ve zamana bağlı değişimini incelediğimiz bu çalışmada hastanemize rutin kontrol amacıyla gelen T. gondii ile enfekte olan 18 yaş ve üstü beş gönüllü kadından alınan serum örnekleri farklı ortam sıcaklıklarda 72. saate kadar saklanarak ELFA testi ile çalışıldığında anti-T. gondii IgG antikor seviyelerinde anlamlı bir farklılığın bulunmadığı gözlemlenmiştir.

Hastalara ait kan tüplerinin laboratuvara gönderilmesinin unutulması, gecikmesi, serum örneklerinin farklı sıcaklıklarda uzun süre beklemesi ya da bir ilin laboratuvarından başka ilin laboratuvarına kargo ile serum örneklerinin gönderilme süresinin 72 saate kadar uzaması gibi durumlarla karşılaşılabilmektedir. Çalışmamızdan elde edilen sonuçlar, serum örneklerinin bekletilmeden çalışılması ile 72. saate kadar farklı ortam koşullarında saklanarak çalışılmasının anti-T. gondii IgG antikor seviyelerini klinik olarak anlamlı düzeyde etkilemediğini göstermiştir.

Sonuç olarak hastaların tekrar polikliniğimize davet edilerek kan örneği alınmasına gerek olmadığı sonucuna varılmıştır. Ayrıca hasta sayısın artırılması ve serum örneklerin 72 saatten daha uzun süre saklanarak değerlendirilmesi ile daha geniş kapsamlı araştırma verilerine ulaşılabileceği kanaatine varılmıştır.

* Etik