ÖZ

Toxoplasma gondii (T. gondii) oldukça karışık olan yapısı ile hekimleri ve veteriner hekimleri ilgilendiren, zorunlu hücre içinde bulunan, zoonotik protozoan bir parazittir. Dünya nüfusunun yaklaşık üçte birini enfekte ettiği bilinmektedir. Zoonoz bir hastalık olması nedeniyle insan maruziyetini önlemek için, hayvan popülasyonunu da kontrol altında tutmak gerekir. T. gondii tespiti ile ilgili birçok çalışma yapılmış vetip 1, 2, 3’ten oluşan üç klonal grubu olduğu tespit edilmiştir. Moleküler çalışmalarda oluşan gelişmeler paraziter hastalıklarda da taksonominin değişmesini ve yeni gelişmelerin oluşumunu sağlamıştır. Tanı, tedavi, antiparaziter ilaçların geliştirilmesi ve direncinin araştırılmasına yardımcı olmuştur. Ayrıca paraziter hastalıkların aşı çalışmalarının, genetik tiplendirmesinin ve filogenetiğin araştırılmasını da sağlamıştır. Bugün yapılan konvasiyonel polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), gerçek zamanlı PZR ve genotiplendirme çalışmaları T. gondii hakkındaki bilgimizi artırmaktadır. PZR’de en fazla B1, SAG1, SAG2, GRA1, 529-bp repeat element, OWP genleri ve 18S rRNA’lar ve genotiplendirmede ise MS, MLST, PZR-RFLP, RAPD-PZR ve HRM gibi yöntemler kullanılmaktadır. Toxoplasmosis tek sağlık kavramı çerçevesinde yer alan ve ilgi çekmesi zorunlu, Dünya’da halen eradike edilememiş ve edilmesi için insan, hayvan ve ekosistem için ortak çalışmalara ihtiyaç duyan bir hastalıktır. Bu ancak disiplinlerarası gruplar kurup, sürveyans ve eğitim çalışmaları yaparak mümkün olabilir.

Anahtar Kelimeler: Moleküler çalışmalar, PZR, Toxoplasma gondii

GİRİŞ

Toxoplasma gondii (T. gondii) yaklaşık 120 yıldır bilinen, oldukça karışık olan yapısı ile hekimleri ve veteriner hekimleri ilgilendiren ve konu ile ilgili birçok çalışmayı bünyesinde barındıran protozoan bir parazittir. Günümüzde bu parazitin etiyolojisi, morfoloji ve yaşam siklusu, immünitesi, korunma ve bulaş mekanizmaları, teşhis, tedavi ve aşılama çalışmaları ile ilgili yüzlerce çalışma yapılmış ve bilim dünyasının hizmetine sunulmuştur. T. gondii dünya nüfusunun yaklaşık %30’unu enfekte etmiştir (1, 2). Sadece insanları değil, tüm sıcakkanlı ve bazı soğukkanlı  hayvanları ve tüketimdeki su, gıda vb.’ni de enfekte edebilme potansiyeli olması nedeniyle, tek sağlık çerçevesinde değerlendirilmesi gereken zoonotik bir parazittir (3). Hücre içine yerleşebilen bu parazit, bulaş mekanizmalarının artması ve konakçı hücreden kaçabilme potansiyeli olan, komplike bir yapıya sahiptir. Parazitin hızlı üreyen formu olan takizoitlerinin, organizmanın savunma mekanizmalarından kaçabilmek adına uzun yıllar sessizce bekleyebilen formu olan, doku kisti ve bradizoit formuna dönüşebilmesi mümkündür (4). Bu yetenek parazitin komplike yapısını artırmaktadır. Felidea ailesinin fertlerinin ince barsaklarında, seksüel olarak çoğalıp gelişen ookist ise sporülasyondan sonra enfekte edebilme potansiyeli olan formudur (5, 6).

Toxoplasmosis uzun yıllardır hekimlerin ve veteriner hekimlerin dikkatini çekmektedir. İmmünitesi sağlam kişilerde %90 oranında asemptomatik olarak seyreden T. gondii, son zamanlarda immün sistemi baskılanmış hastaların (AIDS, kanser ve immünosüprese bazı ilaçları kullanan kişiler vb.) sayısının artışı ile parazitle oluşan ciddi hastalıkların görülme potansiyelini de artmıştır. Ayrıca konjenital toxoplasmosis, oküler toxoplasmosis ve parazitin reaktivasyon ile gelişimi ölümcül olabilecek komplikasyonlara yol açtığından, klinik olarak dikkat çeken bir parazittir (2). Bunun yanı sıra T. gondii ciddi ekonomik kayıpların ve düşüklerin oluşumu ile ülke ekonomisini etkileyebildiğinden veteriner hekimlerin de ilgi alanına girmiştir (7). Türkiye’de evcil hayvanlar ve vahşi hayata dair de birçok çalışma yürütülmüştür. Bunlarda T. gondii pozitiflik oranları araştırılmış ve ekonomik zararları tartışılmıştır (8). Zoonoz bir hastalık olması nedeniyle insan maruziyetini önlemek için hayvan popülasyonunu kontrol altında tutmak gerekir. Veteriner hekimler koyun sürülerinde düşük yapmayı önleyici antiparaziter aşı bulmuştur. Ancak tüm çabalara rağmen insanlarda tam olarak bir aşı geliştirilememiştir (7).

Toxoplasma gondii için Moleküler Çalışmalar

T. gondii enfeksiyonunda etkenin saptanmasına yönelik birçok yöntem vardır. Tanıda kullanılan bu yöntemlere ait antijen ve/veya antikorlar Tablo 1’de sunulmuştur.

Bu serolojik metotlar, oldukça zor olsa da, özellikle hamile kadınlarda ve düşük durumlarında yorumlanması zaruri durumlardır. Fetüsün enfekte olup olmadığı kararını vermek tedaviye başlamak için son derece önemlidir. Şüpheli durumlarda amniyotik sıvıda polimeraz zincir reaksiyon (PZR) analizleri gerçekleştirilmeli ve kesin tanı konmalıdır. Ancak amniotik sıvıdan örnek alma işlemi fetüs için oldukça riskli bir konudur ve insanlarda 18. gebelik haftasında veya daha sonra gerçekleştirilmesi önerilir. PZR analizleri tanı koyma ve paraziti tanımlama yöntemlerinde yardımcı olmaktadır (2).

Yapılan diğer PZR çalışmaları sonucu Kuzey Amerika ve Avrupa’da görülen T. gondii suşları, üç gruptur. Bunlar tip 1, 2 ve 3’tür. Ayrıca Multilokus RFLP analiz tekniği ile de bu üç klonal grup bulunmuştur (10). Son araştırmalar, Güney Amerika’da tespit edilen suşlarının ise genetik olarak farklı olduğunu ortaya koymuştur. İnsan enfeksiyonlarında (Kuzey Amerika ve Avrupa) ve tarım hayvanlarında tip 2 suşların yaygın olduğu görülmüştür. Tip 1; insanlarda nadirdir ve özellikle farelerde yüksek oranda virülansa sahiptir. Tip 2; farelerin daha az etkilendiği, çoklukla insan, koyun ve domuzlardan elde edilen ve kiste dönüşümü oldukça kolay olduğu bir suştur. Tip 3; rekombinant veya sıra dışı aleller ile belirlenen tiptir. Sıklıkla vahşi hayvanlarda ve insanda sıra dışı olarak izole edilen bir suşdur (11). Tip 1 dünya çapında nadirdir. Tip 2 ve tip 3 suşları Brezilya (nadir) dışında dünya çapında yaygındır. Son çalışmalar atipik suşları 4. klonal grup olarak tanımlamıştır. Atipik suşlardan biri olan Afrika 1 suşu ise Sahraaltı bölgelerden gelen insanlarda tanımlanmıştır (12).

Son 30 yılda moleküler çalışmalar hızla artmıştır (13). Özgüllüğü ve duyarlılığı yüksek yöntemlerin ortaya çıkması ile tanısal yaklaşımlar güçlenmiştir. Tanı, tedavi, antiparaziter ilaçların geliştirilmesi ve direncinin araştırılmasına yardımcı olmuştur. Ayrıca paraziter hastalıkların aşı çalışmalarının, genetik tiplendirmesinin ve filogenetiğin araştırılmasını da sağlamıştır (14). Her ne kadar çoklukla kullanılsa da, geleneksel yöntemler sınırlı tanı yöntemleridir. Moleküler yöntemler artık bu konuda tanımlama testleri olarak kullanılmaya başlamıştır (15).

Konvansiyonal PZR yüksek sensitiviteye sahip bir yöntemdir. T. gondii’nin PZR ile belirlenmesinde en sık B1 (majör yüzey antijeni) gen bölgesi kullanılır (16). T. gondii’nin tanımlanmasında SAG1, surface antigen of T. gondii (SAG2), 529 bp repeat element, internal transcriber spacer (ITS-1), 18S rDNA, dense granule protein 1 (GRA1) gibi gen dizileri kullanılabilmektedir. B1 geninden daha hassas olan 529 bp repeat element, daha az hassas ise ITS-1 ve 18S rDNA’dır (Tablo 2) (17).

Gerçek zamanlı PZR DNA’nın çoğaltılması ve görüntülenmesinde floresan işaretli prob ve boyalar (SYBR Green 1, Etidyum bromid) kulanılan bir yöntemdir. Toxoplasmosisin tedavisinin hangi boyutlarda olduğu ve hastalığın takibi açısından moleküler yöntemlerin ilerlemesi ve kullanılması oldukça önemlidir. Bu yöntemler ile T. gondii DNA’sı kanda, amniyotik sıvıda ve beyin omurilik sıvısında bulunabilmektedir (18).

PZR yöntemleri çevresel numunelerde de enfeksiyon yayılımı açısından önemlidir. Sadece su banyosu ve ısı bloğu gibi ucuz malzemeler ile gerçekleştirilen LAMP alternatif bir yöntemdir. Bu yöntem kontaminasyona duyarlı olduğu için kalite kontrol de gerektirir. T. gondii DNA’sının tespiti LAMP ile klinik numunelerle yapılmaktadır. Su örneklerinde ise T. gondii B1, SAG1, SAG2, GRA1, 529-bp repeat element, genleri ve 18S rRNA’ları tanımlamak gerekmektedir. LAMP yöntemi ile; B1 ve OWP genleri ile takizoit DNA’sı belirlenirken, SAG1’e tanımlamasıyla erken tanımlama gerçekleştirilir (19, 20).

T. gondii’yi genetik olarak tanımlayabileceğimiz hedef gen bölgeleri ve kullanılan yöntemler Tablo 2’de sunulmaktadır.

Toxoplasmosis epidemiyolojik araştırmalarında genotip tanımlaması yeni çalışmalar ve araştırmalar için taban oluşturmaktadır. Genotiplendirme ile yeni suşların tanımlaması yapılırken taksonomik tanımlamalar da mümkün olabilmektedir. Bu çalışmalar MS, MLST, PZR-RFLP, RAPD-PZR ve HRM gibi yöntemler kullanılarak yapılmaktadır (9).

T. gondii’nin yapılmış ve yapılmakta olan tüm genom çalışmaları (WGS) paraziti tanımada yardımcı olmaktadır. Bu çalışmalar ayrıca referans genomla yapılmış olan tüm genom çalışmasının karşılaştırılması sonucu, yeni genomda varolan polimorfizmleri, çeşitlerini ve özelliklerini tanımlayabilir. Bu şekilde yapılan tüm genom çalışmaları bize; parazitin vital fonksiyonlarını, virülans bölgelerini kodlayan proteinleri ve bunlardaki polimorfizmleri de tanımlayabilir. Ayrıca parazitin tanısı için gerekli olan hedef gen bölgelerini bulmamıza yardımcı olur. Bununla beraber T. gondii ile ilgili ilaç üretimi ve aşı hedef bölgelerini tespit etmekte yararlıdır. Günümüzde yeni nesil dizileme teknolojilerinin gelişmesiyle WGS çalışmaları hızlanmıştır. T. gondii’nin günümüze kadar [NCBI veri bankası (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/?taxon=5811) verileri 19.08.2023 tarihine kadar taranmıştır] tespit edilmiş 28 genom mevcuttur. Referans genom T. gondii ME49’dur (ABD). WGS’ler insan ve hayvanlardan izole edilmiştir. Türkiye’den izole edilen T. gondii genomu ise T. gondii TR01’dir (21). Bunlar;

Tüm bu genom çalışmaları T. gondii genomunun yüksek oranda korunduğunu göstermektedir. T. gondii’nin genotiplemesi için elde edilmiş olan suşun minimum kontaminasyon ve kalitede olması gerekir. Çalışmaları devam eden suşlarda T. gondii DNA’sına sahip olmak ve bunu da canlı suşlardan sağlamak mümkün olur (2).

PZR analizlerinde ortamda parazit DNA’sının bulunması elzemdir. PZR tekniği insan kan örneklerinde hızlı, duyarlı ve spesifiktir. Ancak fetüste ve bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda PZR sonuçları pozitif bulunduğunda tedavi şarttır. Fakat negatif olduğunda bu sonuç toxoplasmosisi dışlamaz (23). PZR analizleri yapılırken duyarlık ve özgüllüğü yüksek olan gen bölgeleri tercih edilmeli ve pozitif/negatif kontrol örnekleri ile birlikte değerlendirilmelidir (24). PZR yöntemleri ile ortamda az sayıda bulunan nükleik asitlerin sayısı çoğaltılmakta, daha sonra saptanabilir düzeye erişen bu moleküllerin varlığı gösterilmektedir (15). RT-PCR ve nested PZR T. gondii DNA’sını belirlemede konvansiyonal PCR’den daha başarılıdır. Kompalic-Cristo ve ark. (25), RT-PZR ile DNA konsantrasyonları düşük olduğunda dahi parazit yükünü doğru bir şekilde ölçebildiğini göstermişlerdir. Yanlış PZR negatif sonuçlar, amnion sıvısında yeterince DNA yükü olmaması, örneklerin uygun şekil ve zamanda alınmaması, teknik sorunlar ve plasentaya geç nüfuz etmiş T. gondii gibi nedenlerle olabilir (24, 26). Kandan PZR analizi yapılırsa pozitif sonuç enfeksiyonu doğrular, ancak negatif sonuç enfeksiyonu dışlayan bir özellikte değildir (27). PZR T. gondii’nin erken tanısında etkin olan ve kan örneği ise hayvan ve insan olgularının tanısında gereken en önemli örnektir. Ancak kan örnekleriyle toxoplasmosis için bazen farklı sonuçlar alınabilir. Takizoit, bradizoit ve sporozoit ile enfekte olma, kan enfeksiyonunun süresi ve parazitin kanda kalıcılığı testin pozitifliğini etkiler (28).

SONUÇ

Tek sağlık çerçevesinde bakıldığında insanlarda ve hayvanlarda toxoplasmosis açısından hala yetersiz bilgi seviyesine sahip olduğumuzu görmekteyiz. Zoonotik bir enfeksiyon olması ve yüzlerce moleküler çalışmanın yapılmış olması dahi bilgi dağarcığımızın artırılmaya muhtaç olduğunu göstermektedir. Tek sağlık insan ve hayvan sağlığına, çevre ve bitki sağlığına odaklanan yapıları bünyesinde barındırır. Toxoplasmosis tek sağlık kavramı çerçevesinde yer alan ve ilgi çekmesi zorunlu, dünyada halen eradike edilememiş ve edilmesi için disiplinlerarası (insan-hayvan-ekosistem) ortak çalışmalara ihtiyaç duyan bir hastalıktır (29). Bugün dünya ticaretinin ve hayvan hareketlerinin çok fazla oluşu da enfeksiyonu önlemedeki handikaplardandır. Gelişmekte olan moleküler teknolojilerin dahi, parazitin karmaşık yapısını tanımlamakta zorluk çektiği bilinmektedir. T. gondii DNA’sının serebral, oküler ve konjenital toxoplasmosis açısından araştırılması ve PZR testlerinin pozitif çıkması ensefalit açısından kesin tanı koydurucudur. Yüksek duyarlık ve özgüllüğü olmasına rağmen bu yöntem toxoplasmosis varlığını dışlayamamaktadır. Amnioz sıvısında ile gerçekleştirildiğinde ise daha zor bir hal almaktadır. PZR sayesinde insan ve hayvanlarda T. gondii’nin erken tanısı önemli olmuştur. Akut enfeksiyonun tanımlanması özellikle insanda gereklidir. PZR’da hazır kitlerde en fazla kullanılan hedef bölge T. gondii B1 gen dizisidir. SAG1, SAG2, GRA bundan sonra gelen bölgelerdir. Günümüzde tedavisinde kullanılan ilaçlar takizoitleri hedef almakta, bradizoit formuna etkili olamamaktadır. Dolayısıyla parazitin tedavisi de zorlaşmaktadır (30). Dünya’da toxoplamosisin immün sistemi baskılanmış hastalarda mortalite ve morbiditeyi artırdığı gözlemlenmiştir (31-33). T. gondii enfeksiyonunun hızla yayılımı ve ookist dağıtımını önleyici faaliyetlerde bulunmak gereklidir. Bu amaçla T. gondii’yi ve dağılım mekanizmalarını tam olarak anlatmak ve hekim, veteriner hekim ve diğer ekosistem araştırmacılarının da içinde disiplinlerarası gruplar kurarak enfeksiyonu önlemeye çalışmak gerekmektedir.

* Etik

Finansal Destek: Yazar tarafından finansal destek alınmadığı belirtilmiştir.