GİRİŞ

Trichomonas vaginalis (T. vaginalis), yaşam döngüsünde sadece trofozoit formu bulunan ancak kist formu bulunmadığı bilinen tek hücreli bir protozoondur (1). Yaşamını tek konağı olan insanda, alt genitoüriner sistemde sürdüren bu parazitin, ortalama uzunluğu 8-30 µm ortalama genişliği ise 5-10 µm’dir (1). Cinsel yolla bulaşan non-viral etkenler arasında sık görülen T. vaginalis, Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre 15-49 yaş kadın ve erkeklerde 2016 yılında 156 milyon yeni olgu bildirilmiştir (2). Trichomonas vaginalis’in neden olduğu hastalık tablosu olan trichomoniasis, sarımsı yeşil köpüklü akıntı, kaşıntı, ağrılı cinsel ilişki, disüri, noktasal hemorajik lezyonların görüldüğü “çilek serviks” ile karakterizedir. Ancak çalışmalar klinik özelliklerin trichomoniasis tanısında tek başına kullanılması durumunda, enfekte kadınların %88’inin teşhis edilmeyeceğini ve enfekte olmayan kadınların %29’unun yanlış bir şekilde T. vaginalis enfeksiyonlu olarak belirtileceğini göstermiştir (3,4). Uygun şekilde tedavi edilmediği takdirde trichomoniasisin, servisit, endometrit, pelvik enflamatuvar hastalık, erken membran rüptürü, çeşitli etkenlerin bulaş riskinde artış ile ilişkisi bulunmuştur (5-7). Bu nedenle klinik tanının yanı sıra çeşitli laboratuvar yöntemleri ile tanı desteklenmelidir.

Trichomonas vaginalis tanısında inceleme materyali kadınlarda vajinal akıntıdır. Karakteristik trofozoit yapıları lam-lamel arasında direkt mikroskobik inceleme ile görülebileceği gibi Giemsa ve Papanicolau gibi boyalı yaymalarda da saptanabilir. İn vitro besiyerlerinde üretilebilen T. vaginalis için sıklıkla cystein pepton liver maltose ve trypticase yeast extract (TYM) besiyerleri kullanılmaktadır. Tanı hassasiyetini artırmak amacıyla günümüzde T. vaginalis enfeksiyonunun saptanmasında polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) testleri kullanılmaktadır (1,8).

Çalışmamızda T. vaginalis’in tanısında direkt mikroskobi, Giemsa boyama ve kültür yöntemleri (TYM besiyeri) ile özgüllüğü ve duyarlılığı yüksek gerçek zamanlı multipleks PZR yönteminin katkısı ve etkinliğinin değerlendirilmesi, ayrıca vajinite neden olabilecek diğer etkenlerin de aynı PZR yöntemi ile eş zamanlı olarak taranması amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Bu çalışma, Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Sağlık Bilimleri Etik Kurulu’nun onayı ile gerçekleştirilmiştir (tarih: 10.07.2019 ve karar no: 20.478.486-35).

Hastalar ve Örnekler

Çalışmamızda, Ceylal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Kadın Hastalıkları ve Doğum (KHD) Polikliniği ile Manisa Şehir Hastanesi KHD polikliniğine başvuran, vajinal kokulu-kokusuz akıntı, vajinal kaşıntı, vajinal ağrı-yanma semptomlarından en az birine sahip, çalışmaya katılmayı kabul ederek onam formu dolduran 100 hastadan rutin muayene esnasında iki adet sürüntü örneği elde edilmiştir. Sürüntü örneklerinden bir tanesi ile TYM besiyerine ekim yapılmış, diğer örnek ile direkt bakı, boyalı bakı ve multipleks PZR yöntemleri çalışılmıştır.

Direkt Mikroskobik İnceleme ve Giemsa Boyama

Hastadan steril eküvyonla alınan akıntı örneği, direkt olarak lam üzerine yayıldıktan sonra bir damla serum fizyolojik ile sulandırılıp lamel kapatılarak değerlendirilmiştir. Değerlendirme için ışık mikroskobunda 40X büyütme kullanılarak hareketli T. vaginalis trofozoitleri araştırılmıştır.

Hastadan steril eküvyonla alınan akıntı örneği, direkt olarak lam üzerine yayılıp kurutulduktan sonra metil alkol ile 2-3 dakika tespit edilmiş ve kurutulmuştur. Giemsa (5 mL distile su + 5 damla Giemsa stok solüsyonu) ile boyanmıştır. Yarım saat boyama sonunda, normal çeşme suyu altında yıkanmış ve kurutularak değerlendirilmiştir. Kamçıları, dalgalı zarı ve aksostili ile tipik T. vaginalis trofozoitleri araştırılmıştır.

TYM Besiyeri ile Kültür

Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Parazitoloji Laboratuvarı’nda usülüne uygun olarak hazırlanan TYM besiyerleri KHD polikliniklerinde +4 °C’de saklanmıştır. Çalışma kriterlerini sağlayan hastaların örnekleri günlük olarak her iki hastaneden toplanmış ve 37 °C’de inkübe edilen örneklerin 7 gün boyunca üreme takipleri yapılmıştır (8).

Gerçek Zamanlı Multipleks PZR işlemi ve Değerlendirme

Gerçek zamanlı multipleks PZR çalışması için gerekli RNA izolasyonu işlemi “QIAamp RNA Blood Mini Kit” (Qiagen, Germany) kullanılarak yapılmıştır. Örnekler çalışma yapılıncaya kadar -20 °C’de muhafaza edilmiştir (9).

Gerçek zamanlı multipleks PZR için “Fast Track Diagnostic STD 9 RUO” kiti kullanılmıştır. Kit içerisinde iki primer prob miksi: Birincisinde Chlamydia trachomatis (C. trachomatis), Mycoplasma genitalium (M. genitalium), Neisseria gonorrhoeae (N. gonorrhoeae), internal kontrol ve pozitif kontrol; ikincisinde ise T. vaginalis, Gardnerella vaginalis (G. vaginalis), Ureaplasma urealyticum/parvum (U. parvum/urealyticum), Herpes simpleks virüs 1/2 (HSV1/2) ve pozitif kontrol yer almıştır (10).

Çalışmamızda her bir örnek için 15 µL master miks; 1,5 µL primer prob miks + 1 µL enzim + 12,5 µL buffer olacak şekilde hazırlanmıştır. Hazırlanan 15 µL master miks içerisine 10 µL pozitif kontrol, negatif kontrol ve hasta izolasyon örneği eklenerek çalışma gerçekleştirilmiştir. Çalışma prosedürü; 50 °C 15 dakika, 94 °C 1 dakika başlangıçtan sonra 40 döngü 94 °C 8 saniye, 60 °C 1 dakikalık olacak şekilde programlanmıştır.

İstatistiksel Analiz

Testler arasındaki uyumu belirlemede veriler SPSS 21.0 (SPSS Inc, Chicago Amerika Birleşik Devletleri) programına kaydedilmiştir. Değerlendirmeler bu programa göre yapılmıştır. Kültür-multipleks PZR arasındaki tutarlılık (uyum) için Cohen’in kappa testi analizi yapılmıştır.

BULGULAR

Çalışmamızın örnek toplama, direkt mikroskobik bakı, Giemsa boyama yöntemi, TYM besiyerinde kültür işlemleri Ekim 2019-Mart 2020 tarihleri arasında gerçekleştirilmiştir. Çalışmamız bir yıl olarak planlanmış ve bu süre içerisinde tamamlanmıştır. Çalışmamıza Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi KHD Polikliniği’nden 31, Manisa Şehir Hastanesi KHD Polikliniği’nden 69 hasta dahil edilmiştir. Bu hasta gurubunda en küçük yaş 20, en büyük yaş 72 olup hastaların yaş ortalaması 38,5 medyan yaşı ise 37 bulunmuştur. Bazı hastaların vajinal akıntı, kaşıntı, yanma-ağrı şikayetlerinin yanı sıra adet düzensizliği, disüri, genital siğil-yara, disparoni, enürezis gibi ek şikayetleri olduğu belirlenmiştir.

Örnekleri alınan 100 hastanın, 6’sında (%6) direkt mikroskobik bakı, Giemsa boyama yöntemi ile T. vaginalis saptanmış ve TYM besiyerlerinde üreme olmuştur. Aynı hasta örneklerinde pozitiflik saptanması nedeniyle parazitolojik tanı yöntemleri olarak tek grupta toplanmıştır. Gerçek zamanlı multipleks PZR test ile 100 hastanın 10’unda (%10) T. vaginalis açısından pozitiflik saptanmıştır (Tablo 1).

Çalışmamızın istatistiği SPSS 21.0 programında hesaplanmıştır. Kappa değeri 0,595 olarak bulunmuştur. Çalışmamız orta düzeyde uyuşma kappa değerine sahip olmasına rağmen iyi düzeyde uyuşma sınırına oldukça yakın olduğu görülmüştür.

Gerçek zamanlı multipleks PZR ile pozitif olduğu saptanan 5 (%50) T. vaginalis pozitif örneğinin direkt mikroskobik bakı, Giemsa boyalı bakı ve TYM kültür yöntemleri ile pozitif olan örnekler olduğu görülmüştür. Parazitolojik yöntemlerin pozitif saptadığı 1 (1/6) (%16,6) örneğin gerçek zamanlı multipleks PZR ile tüm etkenler için negatif olduğu görülmüştür. Gerçek zamanlı multipleks PZR ile T. vaginalis pozitifliği saptanan 10 örnekten 5’i (%50) ise parazitolojik yöntemlerle negatif bulunmuştur (Tablo 1). Multipleks PCR ile T. vaginalis pozitif saptanan hastaların yaş ilişkisi ise Tablo 2’de verilmiştir.

Gerçek Zamanlı Multipleks PZR’da Çoklu Etken Saptama

Çalışmamıza dahil edilen 100 hasta örneğinin 15’i gerçek zamanlı multipleks PZR yöntemi ile hiçbir etkenle pozitif sonuç vermemiştir. Yirmi sekiz örnekte tek, 47 örnekte iki, 8 örnekte üç, 2 örnekte ise dört etken ile pozitiflik saptanmıştır. Çalışmamızda %28 oranında tekli etken, %57 oranında çoklu etken bulunmuştur (Tablo 3).

TARTIŞMA

Vajinit tablosunun oluşmasında, cinsel yolla bulaşan birçok etken veya flora ortamının değişmesine bağlı olarak fırsatçı patojen mikroorganizmalar rol oynamaktadır. Çalışmamızda parazitolojik metodlarla 6 (%6), multipleks yöntemiyle 10 (%10) örnekte T. vaginalis pozitifliği saptanmıştır (Tablo 1). Dogan ve Gitmez (9) çalışmalarında direkt mikroskobik bakı yöntemi ile %6,9 Giemsa boyama yöntemi ile %6,7 kültür yöntemi ile %7,6 ve gerçek zamanlı PZR ile T. vaginalis pozitifliğini %8,6 olarak bildirmiştir. Yazısız ve ark. (10) 2020 yılında yaptıkları çalışmada multipleks PZR kullanarak T. vaginalis sıklığını %1,9 olarak saptamışlardır.

Çalışmamızda parazitolojik yöntemlerden biri olan kültür ile multipleks PZR yönteminin arasındaki karşılaştırmada Cohen’in kappa değeri 0,595 bulunmuştur. Bu çalışmada elde edilen kappa değeri orta düzeyde uyuşmayı göstermesine rağmen iyi düzeyde uyuşma sınırına oldukça yakın olduğu görülmüştür. Mayta ve ark. (11) farklı merkez ve kliniklerden alınan vajinal sürüntüler ile yaptıkları çalışmada kültür yöntemini ve konvansiyonel PZR yöntemini karşılaştırmışlar, kappa değerlerini 0,714 ile 1,000 arasında saptamışlardır. Yine bu çalışmada vajinal örneklerde kültür yöntemi ile karşılaştırıldığında PZR testinin duyarlılık ve özgüllüğü sırasıyla %100 ve %98 olarak bulunmuştur. Pillay ve ark. (12) çalışmasında vajinal yıkama sıvısında klasik PZR ile duyarlılık ve özgüllük %100 bulunurken gerçek zamanlı PZR ile duyarlılığı %100 özgüllüğü ise %82,9 olarak saptamışlardır.

Trichomonas vaginalis pozitifliği, 23-63 arasındaki yaşlarda saptanmıştır (Tablo 2). Pozitif saptanan hastaların ortalama yaşı 37,9 medyan yaşı ise 39’dur. Belirli bir yaş grubunda sıklığın artmadığı görülmüştür. Dogan ve Gitmez (9) yaptıkları çalışmada T. vaginalis oranının %22,9 ile 45-49 yaş aralığında en yüksek olduğunu, İngiltere surveyans ağı çalışmasında da T. vaginalis öyküsü bulunan kadınların 45-64 yaş aralıklarındaki oranlarının daha yüksek olduğunu ifade etmişlerdir (13).

Çalışmamızda C. trachomatis, 4 (%4), N. gonorrhoeae ise 3 (%3) örnekte saptanmıştır (Tablo 2). Nateghi Rostami ve ark. (14) multipleks PZR çalışmalarında C. trachomatis’i %11,67 N. gonorrhoeae’yi ise %5,67 oranlarında saptamışlardır. Çalışmamızda Mycoplasma genitalium saptanmazken, Leli ve ark. (15) multipleks PZR çalışmasında 1,761 kadından alınan örneklerde M. genitalium’un %0,5 oranında saptadıklarını bildirmişlerdir.

Ureaplasma urealyticum/parvum, çalışmamızda multipleks PCR ile %68 (n=68) olarak bulunmuştur. Ancak Kokkayil ve Dhawan (16) U. parvum/urealyticum için, kolonizasyon oranı %40-80 olan fırsatçı patojen olabileceğinden bahsetmişlerdir. Janulaitiene ve ark. (17) çalışmalarında, G. vaginalis’in, çalışmaya dahil edilen kadınların %87’sinde bakteriyal vajinoz tablosu bulunmadığı halde singlepleks PZR ile saptandığı bildirilmiştir.

Groves (18) çalışmasında dünya çapında 400 milyon insan Herpes simpleks virüs 2’nin oluşturduğu genital herpesten etkilendiğinden ve Herpes simpleks virüs 1’in genital herpesdeki rolünün arttığından bahsetmiştir. Aktif lezyon varlığında PZR testlerinin yüksek duyarlılık ve özgüllüklere sahip olması nedeni ile tercih edildiğini vurgulamıştır. Çalışmamızda HSV 1/2, örneklerden sadece 1 (%1) tanesinde saptanmıştır.

Çalışmamızda çoklu etken kombinasyonları da değerlendirilmiştir (Tablo 3). Kim (19) 2013 yılında yaptığı multipleks PZR çalışmasında 1,523 hastadan alınan 1,618 örneğe göre tek başına C. trachomatis %14,2, U. urealyticum %12,7, M. genitalium %2,8, T. vaginalis %1,7, N. gonorrhoeae %0,9 oranında bulmuştur. Ayrıca, T. vaginalis/U. urealyticum birlikteliği %1,5; T. vaginalis/C. trachomatis birlikteliği %0,4; M. genitalium/C. trachomatis birlikteliği %1,1; C. trachomatis/U. urealyticum birlikteliği %0,9; N. gonorrhoeae/C. trachomatis birlikteliği %0,6; M. genitalium/U. urealyticum birlikteliği de %0,4 saptanmıştır. Aynı çalışmada N. gonorrhoeae, T. vaginalis, U. urealyticum üçlü birlikteliği %0,4; M. genitalium, C. trachomatis, U. urealyticum üçlü birlikteliği %0,2 oranında olduğu bildirilmiştir (19).

Çalışmamızda, gerçek zamanlı multipleks PZR test ile T. vaginalis ile G. vaginalis, N. gonorrhoeae, U. urealyticum/parvum kombinasyonlarında tekli etken %20, ikili etken %10, üçlü etken %60 ve dörtlü etken %10 olarak saptanmıştır (Tablo 3). Goo ve ark. (20) T. vaginalis ile U. urealyticum/M. hominis/N. gonorrhoeae/C. trachomatis kombinasyonunun değerlendirildiği çalışmalarında tekli T. vaginalis enfeksiyonunun %8,3 ikili T. vaginalis enfeksiyonunun %33,3 üçlü T. vaginalis enfeksiyonunun %58,4 olduğunu saptamışlardır.

SONUÇ

Çalışmamız sonucunda T. vaginalis tanısında kullanılan direkt bakı ve Giemsa boyama ve kültür yöntemlerinin yanı sıra özgüllüğü ve duyarlılığı yüksek olan PZR yöntemlerinin eklenmesinin tanıyı kolaylaştıracağı ve çoklu etkene bağlı vajinit tablosunda doğru ve etkin tedavinin belirlenmesinde multipleks PZR yöntemlerinin kullanılmasının klinisyenlere yardımcı olacağı kanısına varılmıştır.

TEŞEKKÜR

Çalışmalarımızdaki destekleri için Prof. Dr. Ahmet Özbilgin ve Bio. İbrahim Çavuş’a teşekkür ederiz.

*Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışma, Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Sağlık Bilimleri Etik Kurulu’nun onayı ile gerçekleştirilmiştir (tarih: 10.07.2019 ve karar no: 20.478.486-35).

Hasta Onayı: Alınmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulunda olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

*Yazarlık Katkıları

Veri Toplama veya İşleme: V.T.F., İ.C.B., P.S.H., E.G., Analiz veya Yorumlama: V.T.F., İ.C.B., P.S.H., E.G., Literatür Arama: V.T.F., İ.C.B., Yazan: V.T.F.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Bu çalışma; Manisa Celal Bayar Üniversitesi Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü BAP 2020/027 numaralı proje ile desteklenmiştir.