GİRİŞ
Leishmaniasis, Dünya Sağlık Örgütü’nün ihmal edilen hastalıklar listesinde yer alan ve iklim değişikliği nedeniyle özellikle Avrupa’da kuzeye yayılım trendi gösteren farklı Leishmania türleri tarafından oluşturulan vektör kaynaklı bir protozoon hastalığıdır. Dünya’da milyonlarca kişide enfeksiyona neden olan leishmaniasisin üç temel klinik formu bulunmaktadır; iç organları tutarak karakterize olan formu visseral leishmaniasis (VL), deri tutulumu ile lezyonlara sebep olan formu kutanöz leishmaniasis (KL), mukoza ve deriyi beraber etkileyen ve daha çok Güney Amerika’da görülen formu muko-kutanöz leishmaniasis (MKL) (1). KL, mortaliteden çok morbiditeye sebep olan bir enfeksiyon hastalığıdır. Ateş veya genel semptomlara neden olmadan, genellikle bir veya birden fazla uzun süreli deri lezyonu ile seyreden KL, temelde iki büyük gruba ayrılabilir: Akut KL (AKL) ve kronik KL (KKL) (2). KL lezyonları 2 yıl içinde tedavi ile veya kendiliğinden iyileşmez ise KKL olarak adlandırılmaktadır.
KL, Türkiye’de 1980’li yıllardan beri bildirimi zorunlu hastalıklar arasında yer almaktadır. Sağlık Bakanlığı verilerine göre 2005-2014 yılları arasında 14.587 KL olgusu bildirilmiştir (1). Bu olgular arasında KKL hasta sayısı tam olarak bilinmemekle birlikte, bu tanının konması uzun süreli takip gerektirdiği ve oluşumunun multifaktöriyel bir tablo olduğu göz önüne alındığında, hastalığın seyri ve tedavisinde yaşanabilecek zorluklar daha iyi anlaşılabilecektir.
Leishmaniasis tedavisi açısından da ihmal edilmiş hastalıklardan biridir. Halen tedavinin temelini oluşturan beş değerli antimon bileşikleri 1940’lı yıllarda geliştirilen ajanlardır (3). Leishmaniasis tedavisi, kullanılan beş değerli antimon bileşiklerinin ciddi toksik yan etkileri olması, tedavinin uzun sürmesi, gelişen direnç ve hastanın tedavi uyumsuzluğu gibi sebeplerle başarısızlığa uğrayabilmektedir (4). KL’nin alt tiplerinden olan KKL olgularında ise güncel tedavi yöntemleriyle tedavi başarısızlığı oranı daha yüksek olmaktadır. Bu durum alternatif tedavi seçeneklerini gündeme getirmektedir. VL tedavisinde etkinliği kanıtlanmış ve oral yol ile kullanılan miltefosin, antineoplastik bir ajan olarak geliştirilmiş bir alkil fosfolipid analoğudur (5).
Çalışmamızda oral yol ile kullanılan miltefosinin, leishmaniasisin standart tedavisinde kullanılan meglumin antimoniata (MA) kıyasla, tedavi etkinliklerinin in vitro olarak karşılaştırılması amaçlanmıştır.
YÖNTEMLER
Diyarbakır ve Şanlıurfa’da yaşayan 5 KKL hastasından daha önce izole edilen ve kriyoprezervasyon ile sıvı nitrojende saklanan 5 izolat, R1-R5 şeklinde kodlanarak çalışmaya dahil edilmiştir. Bu çalışma, Celal Bayar Üniversitesi Deney Hayvanları Yerel Etik Kurulu’nun 77.637.435‐55‐27.09.2016 numaralı kararı ile onaylanmıştır.
Örneklerin Zenginleştirilmiş NNN Besiyerine İnokülasyonu ve Leishmania spp. Suşlarının Kültivasyonu
Dondurulmuş Leishmania spp. promastigotlarının yüksek miktarlarda çoğaltılması için; sıvı azottan çıkarılan promastigotlar hızlı bir şekilde çözdürüldükten sonra örnekler klasik Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) besiyerinde üretilemediğinden dolayı, zenginleştirilmiş NNN (Z-NNN) besiyerine ekimleri gerçekleştirilmiştir. Z-NNN besiyerinin bileşiminde klasik NNN besiyerine ek olarak, dana karaciğer ekstraktı vb. zenginleştirici maddeler bulunmaktadır (6). Z-NNN besiyerinde ilk üreme gerçekleştikten sonra fazla miktarda üretmek amacıyla RPMI-1640 besiyerinde kültüre alınmıştır. Ticari olarak temin edilen besiyerine kullanmadan önce %10 FCS, 200 U penisilin/mL ve 0,2 mg/mL streptomisin eklenip, 25 mL’lik hücre kültürü flasklarına 5’er mL dağıtılmıştır. Ekim yapılan flasklar 25 °C’lik etüvde inkübe edilmişlerdir. Parazitlerin çoğalması takip edilerek, 2-3 günde bir taze besiyerinin eklenmesiyle, 1x106/mL yoğunluğunda promastigot ihtiva edecek şekilde, 10 mL promastigot içeren besiyeri elde edilmiştir.
Genotiplendirme
Çalışmada, izolatların genotiplendirilmesi amacıyla internal transcribed spacer 1 (ITS-1) problu gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) testi uygulanmıştır (7). Leishmania parazitlerinin ssu rRNA ve 5.8S rRNA’yı kodlayan genleri ayıran ribozomal ITS-1 bölgesi, Forward primer; 5’-CTGGATCATTTTCCGATG -3’, Reverse Primer; 5¢- GAAGCCAAGTCATCCATCGC -3¢ primerleri, LightCycler-FastStart DNA Master karışımı (Roche Life Sciences) ile birlikte aşağıdaki özgün problar kullanılarak çoğaltılmıştır (7).
Probe 1: CCGTTTATACAAAAAATATACGGCGTTTCGGTTT—FL
Probe 2: LC640-GCGGGGTGGGTGCGTGTGTG—PH
Gerçek zamanlı PZR testi amacıyla hazırlanan toplam 25 µL’lik reaksiyon karışımında; 1,5 µL H20 (PCR grade water), 1 µL Forward Primer, 1 µL Reverse Primer, 0,5 µL Probe1, 0,5 µL Probe2, 12,5 µL QuantiTect Probe PCR Kit Master karışımı (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) ve 5 µL genomik DNA örneği kullanılmıştır.
Leishmania tür ayrımı (L. tropica, L. infantum ve L. major ayrımı) saptanması için belirlenen termal profil; denatürasyon, çoğaltma, erime eğrisi analizi ve soğutma basamaklarından oluşur ve Rotor-Gene (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) cihazının programında çalışma protokolleri olarak önceden kayıtlı olarak bulunmaktadır.
Rotor-Gene’de melting analizi yapılarak sonuçlar elde edilmiştir.
İn vitro Miltefosin Etkinlik Testleri
Bu beş izolata, MA ve miltefosine karşı etkinliklerinin saptanması için iki ayrı yöntem ile in vitro ilaç etkinlik testleri uygulanmıştır. MA ve miltefosinden hazırlanan seri sulandırımlar (4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ve 512 µg/mL) RPMI 1640 besiyeri (%15 FCS eklenmiş) içinde 96’lık düz tabanlı hücre kültürü plaklarında 100 µL olarak hazırlanmıştır. Logaritmik fazdaki Leishmania spp. promastigotları (1x106/mL) 100 µL olacak şekilde her bir çukura eklenmiştir. Plaklar 48 saat 24 oC’de inkübe edilmiştir. Yirmi dört ve kırk sekiz saat sonra ilacın Leishmania spp. promastigotları üzerindeki etkisi:
A. Deney ve kontrol grubu için hazırlanmış besiyerlerindeki parazit sayıları hemositometre lamında sayılarak belirlenmiş,
B. XTT (sodium 3,39-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzene sülfonik asit hidrat) hücre proliferasyon kiti ile canlılıkları değerlendirilmiştir. XTT yöntemi 3 aşamadan oluşmakta olup, birinci aşamada hücreler olası toksik maddeye maruz bırakılmış, ikinci aşamada ortamdaki toksik madde uzaklaştırıldıktan sonra XTT eklenir ve 1-4 saat boyunca inkübe edilir ve son aşamada da renk değişimi spektrofotometrik yöntemle ölçülerek viabilite ölçümü yapılmıştır (8). Deneyler üç kez tekrarlanmış olup, kontrol grubu olarak ilaç eklenmemiş besiyerleri kullanılmıştır (9).
İstatistiksel Analiz
Verilerin istatistiksel olarak değerlendirilmesinde GraphPad Prism 7 (Chicago, ABD) paket programı kullanılmıştır. Normal dağılıma uyan ölçümsel değişkenlerin arasındaki farkın anlamlılılığı, tek yönlü varyans analizi (One-Way ANOVA) ile belirlenmiştir. Bunu takiben Sidak’ın çoklu değişken karşılaştırma testi, GraphPad Prism 7 rehberine uygun olarak uygulanmıştır (10).
BULGULAR
KKL İzolatlarının Genotipleri
KKL olarak sınıflandırmış olduğumuz rezidivan ve lupoid tipteki KL lezyonlarından elde edilmiş 5 adet izolatın tamamının L. tropica olduğu saptanmıştır (Şekil 1).
İn vitro MA ve Miltefosin Etkinlik Testi Sonuçları
İlk 24 saat sonunda yapılan hemositometri ve XTT testleri sonucunda, miltefosin ve MA’nın tam leishmanisidal etki gösterdiği minimum konsantrasyon sırasıyla 128 µg/mL ve 256 µg/mL olarak saptanmıştır (Şekil 2). Kırk sekizinci saatteki incelemede, miltefosin ve MA’nın sırasıyla minimum etkin konsantrasyonu 32 µg/mL ve 64 µg/mL olarak izlenmiştir (Şekil 3). Hemositometri ile sayım ve XTT yöntemi sonuçları korelasyon göstermektedir. Kontrol grubundaki promastigotların ise yüksek miktarlarda canlılıklarını sürdürdükleri görülmüştür.
İstatistiksel Analiz
İn vitro test sonuçlarının yapılan istatistiksel analizinde; miltefosin ve MA’nın doz ve zamandan bağımsız olarak, ilaçsız kontrole kıyasla anlamlı etkinliği olduğu saptanmıştır (p-değeri <0,0001). Buna karşın miltefosin ve MA arasında, tüm konsantrasyonlar ve tüm saatler göz önüne alındığında, etkinlik açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmemiştir (p-değeri >0,05).
TARTIŞMA
Leishmania türlerinin çeşitli kimyasal sınıflardan bir dizi ilaç molekülüne tepkilerini vurgulayan deneysel kanıtlar giderek artmaktadır. Bu çalışmalarda kullanılan farklı test koşulları mevcut olsa da, bazı Leishmania türleri arasında ilaç hassasiyetinde farklılıklar olduğu açıktır ve bu insan hastalığının tedavi rejimlerinin sonucunu etkileyebilir (11). İlaç direnci, Leishmania parazitinin ilaca duyarlı olmasından, ilaca cevap verilmemesine kadar gelişebilecek tüm süreçleri ifade eder. İnsan enfeksiyonlarında bu durum, hastanın tedaviye yanıtsızlığı veya tedaviden sonra relapsların ortaya çıkması veya KKL’de olduğu gibi farklı klinik şekiller olarak kendini gösterebilir. Tedavi başarısı; bağışıklık durumu, beslenme, yaş ve cinsiyet gibi konak faktörlerinden ve aynı zamanda ilgili ilaçların farmakokinetik özelliklerinden de etkilenir (12,13).
Günümüzde yoksulluğun bir hastalığı olarak tanımlanan KL’de kronikleşen hastalık tablosu, uzayan tedavi sürelerine, direnç gelişimi endişesiyle çoklu ilaç kullanımı seçeneklerinin gündeme gelmesine, neredeyse tamamı parenteral olarak uygulanan ilaçlar dolayısıyla hastane yatışı gereksinimine ve relapsların önlenmesi açısından, uzun dönem hasta takibine sebebiyet verebilmektedir (14). Bu durum, uzayan tedavi süreleri ve birim maliyetleri son derece yüksek olan ilaçların kombine kullanımı gerekçeleriyle çok yüksek tedavi giderlerine sebep olmaktadır. Bununla beraber, hastane yatışı gerekçesiyle gelişebilecek hastane enfeksiyonları gibi risklerin yanı sıra, uzun dönemli hasta takibinin beraberinde getireceği lojistik birçok soruna yol açabilmektedir. Tüm bu sebeplerden ötürü, hastalığın endemik olarak görüldüğü, neredeyse tamamı gelişmekte olan ülkeler listesinde bulunan bölgelerde hastalık kısır bir döngüye girmektedir (15).
KL tedavisinde uzun yıllardır altın standart tedavi seçeneği olarak kullanılan antimon bileşikleri, parenteral yolla sistemik veya intra-lezyoner enjeksiyon şeklinde uygulanabilmektedir. Giderek artan sayıdaki dirençli olgular, amfoterisin-B gibi alternatif tedavi yöntemlerinin önünü açmış olsa da, amfoterisin-B tedavisinde, ciddi hepatotoksisite gelişme riski, hastane yatış gerekliliği ve çok yüksek maliyetler gibi sebepler, tedavi alternatiflerinin aranmasına yol açmıştır. Bu noktada, VL hastalarında uzun süre boyunca güvenle kullanılan ve başarılı sonuçlar elde edilen miltefosin, tedavi zorluklarının en belirgin şekilde ortaya çıktığı KKL hasta grubunda önemli ve değerli bir tedavi alternatifi olarak göze çarpmaktadır. Oral yolla kullanım hasta uyumunu artırırken, amfoterisin-B’ye kıyasla düşük yan etki profili de bir diğer önemli avantaj olarak kendini ortaya koymaktadır. Uzun yarılanma ömrü direnç gelişimi açısından endişe yaratabilecek bir husus olmasına rağmen uygun bir ilaçla kısa süreli kombinasyonları bu sorunu ortadan kaldırabilmektedir (16).
Yaptığımız bu çalışmada, KKL hastalarından elde edilen Leishmania izolatlarında, in vitro olarak ilaç etkinliği değerlendirilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla ülkemizde ve dünyada en sık kullanılan anti-leishmanial ilaç olan antimon bileşiklerinden MA ve düşük yan etki profili, kolay kullanım avantajı ve maliyet açısından göze çarpan yeni bir anti-leishmanial ajan olan miltefosin etkinliği karşılaştırılmıştır.
VL için Hindistan’da ilk seçenek ilaç durumuna gelen miltefosinin KL için kullanımı da yaygınlaşmaktadır. Mart 2014’te Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi, gebe veya emzirmeyen erişkinlerde ve ergenlerde KL’nin tedavisinde oral ajan miltefosini onaylamıştır (17). Her ne kadar, VL’de miltefosin kullanımı yaygın da olsa, tüm Leishmania türlerine bağlı KL olgularında kanıta dayalı faz IV çalışmaları yeterli miktarda değildir. Farklı Leishmania türlerini kapsayan in vitro ve in vivo modeller oluşturulmuş ve umut verici sonuçlar alınmıştır (18).
HIV ile birlikte visseral ve kutanöz tutulumlu leishmaniasisi olan hastalarda yapılan bir çalışmada, antimonlar ve lipozomal amfoterisin-B’ye karşı direnç gelişimi veya relapsların görüldüğü bir hasta grubunda, oral miltefosin kullanılmış ve gerek ilaç etkinliği gerekse de hastaların ilaç toleransı açısından etkili sonuçlar alınmıştır (19). Hollanda’da L. major ve L. infantum ile enfekte iki KL olgusunda yapılan klinik bir çalışmada, oral miltefosin’in lezyon üzerindeki parazit sayısında hızlı bir gerileme sağladığı ve uzun süreli takiplerinde de, yarılanma ömrü uzun olmasından dolayı kalıcı bir sağaltım sağladığı izlenmiştir (20).
Miltefosinin KL hastalarında kullanıldığı örnekler, genel olarak Güney Amerika kıtasından ve L. braziliensis ile enfekte olgular ile yapılan çalışmalarda ortaya konmaktadır (21).
Bizim çalışmamızda, tüm KKL izolatlarının L. tropica olduğu yapılan genotiplendirme ile gösterilmiştir. Antroponotik KL etkeni olan L. tropica ile enfekte hastalarda miltefosin etkinliğinin araştırıldığı çalışmalar sınırlıdır. Kanada’da, Afganistan’dan dönen altı KL hastası asker ile yapılan bir çalışmada, tüm hastaların lezyonları kuru tip olarak sınıflandırılmış ve iki hastada da genotiplendirme ile L. tropica ile enfekte oldukları gösterilmiştir. Tüm hastalara çeşitli sebeplerle oral miltefosin tedavisi verilmiş ve şifa sağlanmıştır (22). İngiltere’de, L. tropica ile enfekte iki KL hastası Afgan mülteci ile yapılan bir çalışmada, oral miltefosin tedavisi uygulanmış ve hastaların tam iyileşme gösterdiği ve relaps gelişmediği bildirilmiştir (23).
SONUÇ
İn vitro çalışmaların sonuçları karşılaştırıldığında, miltefosin ve MA gruplarının kontrol gruplarına kıyasla belirgin tedavi edici etkisi olduğu gözlenmiştir. Buna rağmen miltefosin ve MA gruplarının tedavi etkinliği açısından, gerek hemositometri ile sayım sonuçları, gerekse de XTT testi sonuçları arasında anlamlı fark izlenmemiştir. Tüm örneklerde her iki ilacın da yeterli leishmanisidal etki gösterdiği görülmüştür. R1 izolatı, tüm örnekler arasında özellikle MA’ya karşı en yüksek in vitro direnci gösteren izolat olarak dikkati çekmektedir.
KKL olgularında in vitro olarak miltefosin etkinliğinin değerlendirildiği çalışmamızın sonuçları incelendiğinde, miltefosin’in KKL tedavisinde etkin bir ilaç olduğu yönünde güçlü kanıtlar görülmektedir. Tedavisinde zorluklar yaşanan KKL’nin tedavisi amacıyla, miltefosinin etkili ve kullanım kolaylığı olan bir ajan olarak ortaya çıktığı görülmektedir. Bu bilgilerin ışığında, KKL hastalarında miltefosinin ilk tercih olarak akla gelmesi gereken ajanlardan biri olabileceği ve KKL tedavisinde önemli fayda sağlayacağı düşünülmektedir. Ayrıca in vitro sonuçların in vivo hayvan modelleri ile desteklenmesi gerektiği kanaatine varılmıştır.
*Etik
Etik Kurul Onayı: Bu çalışma, Celal Bayar Üniversitesi Deney Hayvanları Yerel Etik Kurulu’nun 77.637.435‐55‐27.09.2016 numaralı kararı ile onaylanmıştır.
Hasta Onayı: Gerek yoktur.
Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.
*Yazarlık Katkıları
Cerrahi ve Medikal Uygulama: V.T., İ.Ç., N.T., Konsept: V.T., M.H., A.Ö., N.T., Dizayn: V.T., M.H., İ.Ç., O.Z., A.Ö., N.T., Veri Toplama veya İşleme: V.T., M.H., İ.Ç., N.T., Analiz veya Yorumlama: V.T., M.H., O.Z., A.Ö., N.T., Literatür Arama: V.T., O.Z., Yazan: V.T., A.Ö., N.T.
Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.
Finansal Destek: Bu çalışma Ege Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı’nın 2017/TIP/017 numaralı projesince desteklenmiştir.