GİRİŞ

Leishmania cinsine ait hücre içi protozoonların neden olduğu leishmaniasis, Dünya Sağlık Örgütü raporlarına (1) göre; 102 ülkede her yıl 1,5 milyon yeni olgunun bildirildiği “ihmal edilen tropikal hastalık” olarak sınıflandırılmaktadır. Hastalık; insanlar dahil olmak üzere diğer memelilere Phlebotomus soyuna bağlı vektör türler ile nakledilmektedir (2). Yapılan çalışmalar ile dünyanın farklı bölgelerinde vahşi, evcil ve sinantropik memelilerin çeşitli türleri Leishmania spp.’nin konakları veya rezervuar konakları sayılmaktadır. Leishmania türlerinin neden olduğu ve köpeklerde görülen kanin leishmaniasis (KanL) dünya çapında yaygın olarak bulunan zoonotik bir enfeksiyon olup, etken köpeklerde genellikle visseral ve kutanöz yerleşim göstermektedir. Ayrıca köpek popülasyonlarının çoğu herhangi bir klinik belirti göstermeksizin etkene maruz kalıp enfekte olabilmektedirler (3). Klinik belirti gösteren enfekte köpeklerde ise; deri lezyonları, lenfadenopati, anemi, oküler lezyonlar, tırnak uzaması, burun kanaması, topallık, iştahsızlık, kilo kaybı gibi bulgular görülmektedir (4,5). Köpekler ile insanların yakın ilişkileri sebebiyle, KanL’nin prevalansının belirlenmesi, özellikle endemik bölgelerde hastalığın epidemiyolojisinin anlaşılması açısından önem taşımaktadır (6).

Ülkemizde hastalığın yaygınlığı üzerine yapılan çalışmalarda; KanL prevelansı Akdeniz’de %12,96, Ege’de %9,08, İç Anadolu’da %5,82, Karadeniz’de %5,38, Doğu Anadolu’da %4,38, Marmara’da %2,40 olarak bildirilmiştir (7). Ozbel ve ark (8) ise hastalığın ülkemizdeki seroprevalansının %2,5 ile %46 arasında değiştiğini ve Türkiye’de KanL ortalama prevalansının %15,8 olduğunu raporlamıştır.

Köpeklerin bağışıklık durumu, klinik bulguların çeşitliliği gibi nedenlerden dolayı hastalığın klinik tanısının zor olduğu bildirilmektedir (9). Vektör kaynaklı ve deri lezyonlarına neden olan diğer hastalıklardan KanL’yi ayırt edebilmek için, hastalığın yönetiminde ayırıcı tanı yapılması gerekmektedir (10). Enfeksiyonun klinik bulguları teşhis amaçlı olarak tek başına çoğu zaman yetersiz kalmakta ve doğru tanı için ileri tanı metotlarına ihtiyaç duyulmaktadır (11). Parazitin amastigot formlarının lenf yumruları, dalak, kemik iliği biyopsilerinde direkt mikroskobi yöntemi ile belirlenmesi güvenli tanı yöntemi olarak görülse de biyopsi uygulamalarının invaziv karakteri ve kullanıcı becerisine bağlı olması (12,13) gibi nedenlerden dolayı hasta sahipleri tarafından pek fazla tercih edilmemektedir. Klinik teşhiste yapılan diğer metotlara göre daha az zaman alan ve daha hızlı terapötik önlemlerin uygulanmasına katkıda bulunan fakat teşhiste tek başına yetersiz kalan ELISA tabanlı hızlı tanı kitleri; özellikle klinik ve klinikopatolojik bulgular, kan biyokimyası gibi diğer sonuçlarla birlikte KanL tanısında ön tanı metodu olarak sıklıkla kullanılmaktadır (14). Fakat hızlı tanı kitlerinin düşük antikor seviyelerine sahip ve asemptomatik köpekleri teşhis etmede yetersiz olması kantitatif teşhis yöntemlerinin kullanılmasını zorunlu kılmaktadır (15-17).

Günümüze kadar, KanL’nin tanısında birçok serolojik ve moleküler tanı metodu tanımlanmış olup, hastalıkta klinik bulguların değişken olması ve parazitin doğrudan belirlenmesindeki zorluklar nedeniyle kesin tanı, duyarlılık ve özgüllüğü yüksek serolojik testler (IFAT, ELISA) ve moleküler tabanlı bir test olan polimeraz zincir reaksiyon (PZR) ile konulabilmektedir (5). Serolojik ve moleküler metotların kombine kullanılması, bireysel teşhis ve epidemiyolojik çalışmalar için daha güvenilir veriler sağlayabilmektedir (18,19). Tüm bunlar göz önüne alındığında bu çalışmada da leishmaniasis yönünden endemik sayılan Ege Bölgesi’nin farklı illerinden Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarları’na gönderilen KanL şüpheli örneklere uygulanan PZR ve immünofloresan antikor (IFA) sonuçlarının değerlendirilmesi hedeflenmiştir.

YÖNTEMLER

KanL’den şüphe edilen farklı ırk, yaş ve cinsiyetteki köpeklerden alınan kan ve/veya serum örnekleri çalışmanın materyalini oluşturmaktadır. Beş yıllık süreç içinde, örnekleri gönderen hekimlerin istemlerine bağlı olarak toplam 80 serum örneğine IFA testi yapılmıştır. Bununla birlikte, etilendiamin-tetraasetik asit tüplere alınmış 27 kan örneği de PZR testi için özel veteriner klinikleri tarafından Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarları’na getirilmiştir. Hastaların bir bölümünün yaş, ırk ve cinsiyet bilgileri kayıt altına alınabilmiştir. Kan ve/veya serum örnekleri kullanılana kadar eppendorflar içinde -20 °C’de dondurucularda muhafaza edilmiştir. 2016-2021 yılları arasında düzensiz aralıklarla laboratuvara gelen örneklerde en geç yedi gün içinde, veteriner hekimin istediği seroloji ve/veya moleküler testin tamamlanması ve sonuçların bildirilmesi işlemleri gerçekleştirilmiştir. PZR ile teşhis istenen hastaların kan örneklerinde “PureLink^© Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen^©)” kit protokolüne uygun olarak DNA ekstraksiyonları gerçekleştirilmiş ve DNA örneklerinde Leishmania spp. varlığını tespit etmek amacıyla, RV1 (5’-CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG G-3’)-RV2 (5’-CCA CCT GGC CTA TTT TAC AC-3’) primer setleri kullanılarak 145 baz çiftlik kDNA minicircle bölgesini çoğaltan PZR protokolü (5, 20) uygulanmıştır. Veteriner hekimler tarafından istemi yapılan IFA testi ise -20 °C’de bekletilen L. infantum promastigotları [lokal L. infantum (MON-1) stok promastigotları, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Parazitoloji Anabilim Dalı] ile hazırlanmış lamlar kullanılarak yapılmıştır. Her bir antijen kaplı lam pozitif, negatif kontroller ile dilusyonları 1:16, 1:64 ve 1:128 (isteğe bağlı) olacak şekilde hazırlanan köpek serum örnekleri içermektedir. Serum örneklerinin pozitifliği için 1:64 değeri cut-off olarak kabul edilmiştir. Retrospektif değerlendirme olarak yapılan bu çalışma için etik kurul onayına ve hasta onamına gerek duyulmamıştır.

İstatistiksel Analiz

Çalışmada ırk, yaş ve cinsiyet verilerinin her köpek için tam olmaması nedeniyle istatiksel analiz gerçekleştirilememiş, ancak elde edilen veriler karşılaştırılmalı olarak tablolarda özetlenmeye çalışılmıştır.

BULGULAR

KanL’den şüphe edilerek veteriner hekimler tarafından gönderilen toplam 80 serum örneğine IFA testi uygulanmıştır. Buna göre serum örneklerinin 37’si (%46,25) IFA testine göre en az bir sulandırmada (1/64 veya 1/128) seropozitif olarak tespit edilmiştir. PZR analizi sadece 27 örnek için talep edilmiş ve bunların da beşi (%18,5) Leishmania spp. DNA’sı varlığı yönünden pozitif olarak tespit edilmiştir. PZR’da pozitif olduğu saptanan beş örneğin tamamının aynı zamanda seropozitif oldukları da IFA testi ile gösterilmiştir. Ayrıca IFA testine göre pozitif olmasına rağmen PZR’de negatif olduğu belirlenen beş örnek tespit edilmiştir. Bu örneklerin dışında kalan 17 örneğin hem PZR hem de IFA testine göre KanL yönünden negatif olduğu belirlenmiştir (Tablo 1). Bilgi kayıt formunda ırk bilgisi doldurulan 47 örnek incelendiğinde IFA ile en fazla pozitiflik melez köpekler (9/16) ve Golden Retriever ırkı köpeklerde (5/7) tespit edilirken, bunun dışında French Bulldog (1/2), Boxer (1/1), Husky (1/1), Doberman (1/1), Kangal (1/2), Labrador (1/2) ve Jack Russell (1/1) ırkı köpeklerde de birer adet seropozitif örneğe rastlanılmıştır. Cinsiyet bilgisi verilen 53 köpeğin 25’inin IFA testi pozitif olarak tespit edilmiştir buna göre; 31 erkek köpeğin 12’sinin (%38,7) ve 22 dişi köpeğin 13’ü (%59) seropozitif olarak belirlenmiştir. Dişi köpeklerden ikisinin PZR testinde de Leishmania spp. DNA’sı varlığı yönünden pozitif oldukları görülmektedir. Ayrıca kayıt formunda belirtilen yaş grupları incelendiğinde 53 köpeğin yaş bilgisine ulaşılmaktadır; en fazla sayıda seropozitifliğin 3-5 yaş grubundaki köpeklerde (11/27) bunu sırasıyla; 6-8 yaş grubu (8/14), 0-2 yaş grubu (4/8) ve 9 yaş üstü (2/4) grubundaki köpekler olduğu tespit edilmiştir. Çalışmaların yapıldığı yıllar incelendiğinde en fazla sayıda IFA ve/veya PZR analizinin 2019 yılında yapıldığı (n=34) ve bunu sırasıyla 2016 (n=13), 2017 (n=2), 2018 (n=8), 2020 (n=16) ve 2021 (Temmuz’a kadar/n=7) yıllarının takip ettiği görülmektedir (Tablo 2).

TARTIŞMA

İnsan ve köpek sağlığını tehdit eden ve Türkiye’de özellikle Ege, Akdeniz, Marmara Bölgeleri’nde (21) endemik olarak görülen KanL’de, asemptomatik köpeklerin rezervuar olarak görev yapmaları nedeniyle köpekler ve Phlebotomus soyuna bağlı vektör sinekler hastalığın yayılmasından sorumlu tutulmaktadırlar. Enfekte köpeklerde görülen klinik belirtilerin teşhiste tek başına yetersiz olması KanL’nin tanısında spesifik testlerin kullanılma ihtiyacını doğurmaktadır (5). Enfeksiyonun tanısında kullanılan epidemiyolojik ve klinik stratejiler, serolojik ve moleküler yöntemler üzerine inşa edilmiştir (15). IFAT, ELISA, c-ELISA, dot-ELISA gibi yöntemler genellikle KanL’nin serolojik teşhisi için tercih edilmektedir (4). Farklı Leishmania türleri arasında çapraz reaksiyon verme riskine rağmen anti-Leishmania antikor tespiti için en çok IFA testi kullanılmaktadır (4,22). Hastalığın belirli bir endemik bölgedeki yaygınlığı, hastalığın epidemiyolojisini anlamak ve kontrol önlemlerine karar vermek için her zaman önem taşımaktadır (23).

Türkiye’nin farklı bölgelerinde yapılan KanL çalışmalarına göre; Kars ilinde %7,27 (IFAT), Kırıkkale ve Sivas’ta %2 (IFAT), Adana’da %27,18 (IFAT) ve %41,74 (PZR), İstanbul %1,96 (IFAT), Samsun’da %0,41 (ELISA, PZR, direkt mikroskopi), Antalya’da %7,95 (IFAT) oranında pozitiflik tespit edilmiştir (24-29). Ayrıca, Kayseri (nested-PZR), Şanlıurfa (IFAT), Burdur (IFAT), Diyarbakır (IFAT), Erzurum (IFAT), Amasya, Ordu, Tokat ve Sinop (ELISA, PZR, direkt mikroskopi) illerinde yapılan çalışmalarda ise KanL yönünden pozitif köpek tespit edilemediği bildirilmiştir (4,28,30-33). Türkiye’de enfeksiyonun endemik olarak görüldüğü Ege Bölgesi’nde KanL seroprevalansı ile ilgili daha önce yapılan çalışmalarda bu oranın %2,5-46 arasında değiştiği farklı çalışmalarla belirtilmiştir (34,35). Çalışma bölgesi olan Aydın’da Toz ve ark.’nın (36) daha önce yaptıkları çalışmada %4,7-9,1 arasında (IFAT, rK39) seropozitiflik bildirilmiştir. Ege Bölgesi’nde bulunan köpeklerde L. infantum’un varlığı moleküler olarak daha önce Toz ve ark (21) tarafından bildirmiştir. Bakırcı ve ark’nın (5) Aydın, Manisa ve İzmir ilini kapsayan; köpeklerde Leishmania spp. DNA tespiti üzerine yaptıkları çalışmada %5,23 (PZR) pozitiflik tespit edilmiştir. Muğla’da köpeklerde yapılan başka bir çalışmada IFA %37,4, PZR testi %6,87 aynı bölgede hastalığın vektörü olan Phlebotomus soyuna bağlı sineklerde yapılan çalışmada ise gerçek zamanlı (real-time) PZR ile %33,8 oranında Leishmania spp. pozitif olarak belirlenmiştir (5,34,37). Yapılan bu retrospektif çalışmada sadece 27 örneğe PZR testi istenmiş ve bu örneklerin beş tanesi (%18,5) PZR pozitif olarak bulunmuştur. Bu çalışmada, PZR sonuçlarının IFA testine göre daha düşük prevalansa sahip olması az sayıda örneğe PZR testi yapılmasıyla, dolayısıyla örneklem sayısı ile açıklanabilir. KanL yönünden endemik bölgelerde hastalığın prevalansını belirlemeye yönelik çalışmalarda örneklem büyüklüğünün önemi daha önceki yapılan çalışmalarda da belirtilmektedir (5).

Retrospektif analize dayanan bu çalışmada, daha önce bildirilen seroprevalans oranlarından yüksek (%46,25) seropozitivite tespit edilmiştir. Bu oranın Türkiye’de köpeklerde KanL seroprevalans ortalaması olarak bildirilen (8) %15,8’den çok daha yüksek olduğu kaydedilmiştir. Bölgede Phlebotomus soyuna bağlı sineklerin yaşaması için uygun ekolojik ortamın varlığı, KanL varlığı yönünden tespiti daha önce yapılamamış köpekler ve çalışmada teste tabi tutulan örneklerin KanL yönünden hasta veya hastalık şüphesi olan köpekler olması bu duruma neden olan faktörler olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte, Özensoy (38) ve Voyvoda ve ark.’nın (39) bildirdikleri üzere bölgede enfeksiyonun uzun yıllardır endemik olduğu ve yıllar içinde teşhis için yapılan test sayılarının artması ile birlikte seropozitif köpek sayısının da artabileceği öngörülmektedir. Çalışmada IFA testi pozitif olarak tespit edilen beş örneğin aynı zamanda PZR testinin de pozitif olduğu, bununla birlikte diğer bir beş örneğin ise IFA testi pozitif iken PZR testinin negatif olduğu belirlenmiştir. Bu durum; PZR ile tespit edilebilir Leishmania DNA’sının elimine edilmesinden sonra bile uzun süre devam eden anti-leishmania antikorlar varlığı (40) veya enfeksiyonun PZR ile tespitinde diğer biyolojik materyallere göre sensitivitesi nispeten düşük olan kan materyalinin (21) kullanılmasından kaynaklanmış ya da düşük düzeydeki parazitemiyi tespit etmede yetersiz kalan PZR duyarlılığı ile açıklanabilir.

Yapılan bu çalışmada dişi köpeklerin %59’unun, erkek köpeklerin ise %38,7’sinin seropozitif olduğu tespit edilmiştir. KanL’nin cinsiyet ile ilişkisi ile ilgili olarak yapılan çalışmalarda; erkek köpeklerin daha çok etkilendiğini (41,42) rapor eden araştırmaların yanı sıra, cinsiyet farkı gözetmeksizin enfeksiyonun görülebildiğini aktaran (43) araştırmacılarda bulunmaktadır. KanL’den en çok etkilenen ırklar konusunda daha önce yapılan çalışmalarda bazı araştırmacılar belli ırkların enfeksiyondan diğerlerinden daha fazla etkilendiği hipotezini reddetmektedir (44). Hem sadece seropozitif köpekleri değerlendiren hem de hastalıklı diğer köpekleri ölçen çalışmalarda Boxer, German Shepherd, Doberman, Rottweiler (45,46) gibi ırklar ön plana çıksa da yapılan bu çalışmada, bütün hayvanların ırk bilgileri bulunmamakla birlikte, en fazla seropozitiflik Melez köpekler ve Golden retriever ırkı köpeklerde görülmüştür. Alvar ve ark. (47) KanL’den etkilenen hayvanlarının yaş dağılımının bi-modal olduğunu; 3 yaş civarında birinci, 8 yaş civarında ise daha az belirgin olan ikinci tepe noktasının görüldüğünü varsaymıştır. Yapılan bu retrospektif çalışmada da Alvar ve ark. (47) gözlemlerine benzer şekilde, seropozitif köpeklerin %44’ünü 3-5 yaş ve %32’sini de 6-8 yaş grupları oluşturmaktadır. Cinsiyet, ırk ve yaş gibi faktörlerin farklı çalışmalarda çelişkili sonuçlar vermesi; çoğu çalışmanın hastalığa yakalanmaya yatkın popülasyonlar yerine genel değerlendirmeye tabi tutulan hayvanlar açısından incelenmesi ile açıklanmaktadır (43).

Yapılan bu retrospektif çalışmada, KanL teşhisi için laboratuvara getirilen örneklerde çoğunlukla sadece IFA test isteminin tercih edilmesi nedeniyle, Leishvet Guidelines (48) ve ESSCAP (49) gibi bilgilendirici uluslararası broşürler ile gerek veteriner hekimlerin gerekse de hasta sahiplerinin konuya dikkati çekilerek; KanL enfeksiyonunda gereken tüm tanı ve tedavi prosedürlerinin eksiksiz yapılması sağlanmalıdır. Bu durum, KanL tanısında sadece ELISA tabanlı hızlı tanı kitlerini kullanan ve daha ileri tanı yöntemlerini birlikte kullanmayı (IFAT ve PZR gibi) tercih etmeyen diğer veteriner hekimlere ya da hasta sahiplerine de doğru şekilde aktarılmalıdır. KanL için; teşhiste tek başına yetersiz kalan klinik belirtiler, duyarlılığı az olan direkt mikroskopi, yanlış pozitiflik/negatiflik ya da çapraz reaksiyon verebilen ELISA tabanlı hızlı kitler ve serolojik testler, kan biyokimyası, uzun zaman alan ve görece pahalı olan moleküler testler dahil olmak üzere; hastalığın teşhisinde bahsedilen tüm yöntemlerin mümkün oldukça birlikte kullanılmasının daha doğru sonuçlar vereceği görülmektedir. Moleküler ve serolojik yöntemlerin bir arada kullanılması subklinik enfeksiyonların tespitinin yanında endemik alanlarda kontrol önlemleri için hedeflenecek köpek sayısının tahmin edilmesine de katkı sağlamaktadır (35,50).

SONUÇ

Zoonotik potansiyeli de göz önüne alındığında oldukça önemli problemlere yol açabilen KanL hem serolojik (IFAT-%46,25) hem de moleküler (PZR-%18,5) olarak bölgede yüksek oranlarda tespit edilmiştir. Hastalığın semptom göstermeden de köpeklerde görülebilmesi nedeniyle bölgede bulunan veteriner hekimlerin hastalık ile ilgili kontrolleri rutin olarak yaparak hastalığın hem tedavisi hem de kontrol programları yönünden halk sağlığına katkıda bulunmasının zarureti görülmektedir. Ek olarak köpeklerdeki enfeksiyon varlığının tespiti için klinik bulgular, direkt mikroskopi, serolojik ve moleküler yöntemlerin birlikte kullanılması bireysel teşhis, epidemiyolojik çalışmalar ve doğru tedavi prosedürlerinin uygulanabilmesi için bir gereklilik halini almıştır. KanL şüphesi olan köpeklerde veteriner hekimlerin ileri tanı yöntemlerinden faydalanarak özellikle serolojik ve moleküler testleri birlikte kullanması, endemik olmayan bölgelere hastalığın yayılmasını önlemek açısından da önem taşımaktadır. Elde edilen veriler, Leishmania spp.’nin neden olduğu enfeksiyon riskinin bölgede yüksek seviyede olduğunu dolayısıyla hem insan hem hayvan sağlığının korunabilmesi için KanL kontrollerinin rutin olarak yapılmasının önemini göstermektedir.

*Teşekkür

Yazarlar, bazı serolojik analizlerin yapılmasında yardımlarını esirgemeyen Veteriner hekim Heycan Berk Aydın’a teşekkürlerini sunar.

*Etik

Etik Kurul Onayı: Retrospektif değerlendirme olarak yapılan bu çalışma için etik kurul onayına ve hasta onamına gerek duyulmamıştır.
Hasta Onayı: Retrospektif değerlendirme olarak yapılan bu çalışma için etik kurul onayına ve hasta onamına gerek duyulmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

*Yazarlık Katkıları

Konsept: M.P., S.B., H.B.B., S.H., T.K., Dizayn: M.P., S.B., H.B.B., S.H., T.K., Veri Toplama veya İşleme: M.P., S.B., Analiz veya Yorumlama: M.P., S.B., H.B.B., S.H., T.K., Literatür Arama: M.P., S.B., Yazan: M.P., S.B., H.B.B., S.H., T.K.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.