GİRİŞ

Fascioliasis, son konak olan insanlar ve otobur memeli hayvanlara kontamine olmuş suların içilmesi veya kontamine olmuş yeşil sebzelerin yenilmesi yoluyla bulaşan zoonotik bir hastalıktır (1). Trematod paraziterlerden biri olan Fasciola hepatica, neden olduğu fascioliasis hastalığının dünya genelinde geniş yayılım göstermesi hem insan hem de hayvan sağlığı ve ekonomi üzerindeki olumsuz etkileri nedeniyle öne çıkan bir parazittir (2,3). Fascioliasis enfeksiyonlarında memeli hayvanlar için enfektif larva dönemi metaserkaryalardır. Bu formların son konak tarafından yutulması sonrasında parazit erişkin döneme geçmektedir (4). Genç parazitler göç esnasında karaciğer parankimasında tahribata ve hemorajiye neden olmaktadır. Erişkin parazitler ise karaciğer ve safra kanallarına yerleştiğinden, buralarda patolojik bozukluklara sebep olabilmektedir (5). Fascioliasis’in ruminantlardaki kontrolü, parazitin dokulara zarar veren erişkin formlarıyla beraber larval formlarını da hedef alan, özellikle triklabendazol başta olmak üzere antelmintik ilaçların kullanımına bağlıdır (6). Bunun yanında, F. hepatica’nın triklabendazol’a karşı direnç geliştirmesiyle ilgili çalışmalar da bulunmaktadır (7,8).

Zoonoz bir parazit olan F. hepatica’nın yaşam döngüsü; omurgasız ara konak olarak su salyangozlarını ve son konak olarak memeli hayvanları içermektedir. Omurgalı konaktan çevreye salınan F. hepatica yumurtalarında, mirasidyum larvaları gelişmekte ve yumurtayı terk eden mirasidyum daha sonra ara konağı olan su salyangozlarına nüfuz etmektedir. Su salyangozunda sırasıyla sporokist, redi ve serkarya larvalarının gelişimi olmakta ve sonrasında su salyangozunu terk eden serkaryalardan dış ortamda metaserkaryalar meydana gelmektedir (4).

Önceden Lymnaea truncatula adıyla bilinen su salyangozu Galba truncatula; F. hepatica’nın başlıca ara konağıdır (9). Bunun yanında F. hepatica’ya ara konaklık yapan Radix spp., Succinidea spp. ve Omphiscola glabra türlerine ait su salyangozları da bulunmaktadır (10,11). Bunlar dışında dünya genelinde Fasciola spp. türlerine ara konaklık yapan 30 adet lymnaeid su salyangozu türü olduğu bilinmektedir (12). Lymnaea stagnalis de F. hepatica’ya ara konaklık yapan tatlı su salyangozu türlerinden bir tanesidir (13). Kuzey Amerika, Avrupa, Kuzey Afrika, Asya ve Avustralya’nın bazı bölgelerinde L. stagnalis türüne rastlanılmaktadır (14,15). Bu tatlı su salyangozu birçok balık, kerevit, amfibi, memeli ve kuş türünün beslenmesinde önemli bir rol oynamaktadır (16).

Bu çalışmada Ağrı ili civarında sulak alanlardan toplanan L. stagnalis türü tatlı su salyangozlarında F. hepatica’nın larval formlarının polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile belirlenmesi amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Salyangozların Toplanması ve Tür Teşhisinin Yapılması

Ağrı ilinde Gürlek ve ark. (17) tarafından yapılmış bir çalışmada araştırma bölgesi haritası üzerinde açık olarak gösterilmiş sulak alanlardan 150 adet tatlı su salyangozu L. stagnalis 2021 yılının Mayıs ayında toplandı. Toplanan tatlı su salyangozları ağzı geniş kapaklı plastik kaplara konuldu ve canlı olarak laboratuvara ulaştırıldı. Salyangozların tür teşhisinde Pfleger’den (18) yararlanıldı.

Salyangozların İşlenmesi

Salyangozlar kloru arındırılmış suda yıkandıktan sonra cam petri kutuları içerisinde diseke edildi. Diseke işlemi sonrasında örnekler, F. hepatica’nın larval formlarını görebilmek amacıyla Leica DM500 mikroskobunda incelendi. İnceleme sonrasında yumuşak doku parçaları -20 °C’de buzdolabında DNA ekstraksiyonu yapılıncaya kadar saklandı.

DNA İzolasyonu ve Konvansiyonel PZR

Salyangozlara uygulanan DNA ekstraksiyonu işlemi, Promega Wizard DNA (ABD) ekstraksiyon kitinin el kitapçığında belirtildiği şekilde gerçekleştirildi. DNA ekstraksiyonu sonucunda elde edilen DNA örneklerinin her birinden birer µL örnek alınarak PZR işlemine geçildi. PZR işleminde sitokrom c oksidaz alt birimi 1 gen bölgesini hedefleyen ve 405 bp’lik bir bölgeyi çoğaltan FhCO1F (5′-TATGTTTTGATTTTACCCGGG-3′) ve FhCO1R (5′-ATGAGCAACCACAAACCATGT-3′) primerleri kullanıldı (19). Hedeflenen bölgeyi çoğaltmak için Taq DNA polimeraz enzimi kullanıldı. PZR işlemi SimpliAmp PZR cihazında gerçekleştirildi. PZR karışımı, cihaz döngü ve sıcaklık dereceleri Cucher ve ark.’nın (19) daha önce gösterdikleri şekilde hazırlandı ve ayarlandı. Pozitif kontrol olarak laboratuvarımızda var olan erişkin F. hepatica örneği kullanıldı. PZR örnekleri %1,5’lik agaroz jelde koşturulduktan sonra etidyum bromür ile inkübe edildi ve ultraviyole ışık altında görüntülendi.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analiz yapılmamıştır.

BULGULAR

 Ağrı ili civarında bulunan sulak alanlardan toplanan tatlı su salyangozu L. stagnalis’te F. hepatica’nın larval dönemlerinin prevalansını belirlemek amacıyla yapılan PZR analizi sonucunda iki (%1,3) örnekte beklenen uzunlukta pozitif bant tespit edildi (Şekil 1). PZR öncesinde yapılan mikroskobik bakı sonucunda ise L. stagnalis’te F. hepatica’ya ait herhangi bir larval form tespit edilemedi. Tatlı su salyangozu L. stagnalis’nin özellikle suların durgun, sığ ve çamurlu olduğu kıyı bölgelerde yoğunlaştığı görüldü (Şekil 2).

TARTIŞMA

Dünya genelinde en az 2,6 milyon insanın Fasciola spp. türleriyle enfekte olduğu tahmin edilmektedir (20). Fascioliasis, genellikle gelişmekte olan ülkelerdeki yoksul insanları etkilemektedir (21). Fascioliasis, insan tüketimine sunulacak büyükbaş ve küçükbaş hayvanların karaciğerini, genel olarak et kalitesini, büyümesini ve üremesini olumsuz etkilemekte ve bazı durumlarda ölümlerine sebep olabilmektedir. Bu nedenle çiftçiler, kasaplar ve nihayetinde tüketiciler ekonomik açıdan olumsuz etkilenmektedir (3,22). Helmintik enfeksiyonlar nedeniyle dünya çapında yıllık toplam ekonomik kayıpların 200 milyar USD’nin üzerinde olduğu hesaplanmıştır (3).

Zoonoz bir trematod parazit olan F. hepatica’nın omurgasız ara konaktaki varlığının rutin olarak belirlenmesi, su salyangozlarının diseke edildikten sonra mikroskop altında parazite ait larval formların görülmesi yoluyla yapılmaktadır. Rutin olarak yapılan mikroskobik bakının özgüllüğü ve duyarlılığı moleküler teşhis yöntemlerinden biri olan PZR’ye göre daha düşüktür. Bunun sebebi su salyangozunda F. hepatica’ya ait larval dönemlerin erken safhalarının kolayca gözden kaçabilmesidir. Ayrıca su salyangozları laboratuvara ulaşamadan veya serkarya salınımı öncesinde ölürlerse, direkt bakı ile mikroskobik inceleme işlemi ciddi olarak olumsuz etkilenmektedir (19). Bu durum, çalışmamızda moleküler yöntem olan PZR ile su salyangozunda F. hepatica’ya ait larval formların varlığını gösteren iki adet pozitif banda rağmen mikroskobik incelemede herhangi bir larval safhanın teşhis edilememiş olmasını da açıklamaktadır. Böylece, moleküler teşhis yöntemlerinin çalışmalarda kullanılmasının önemi bir kez daha ortaya çıkmaktadır.

Tatlı su salyangozları, türüne göre değişmekle beraber suyun farklı bölge ve derinliklerinde yaşayabilmektedir. Ağrı ilinde yapılmış olan bir ön araştırmada L. stagnalis türüne ait tatlı su salyangozlarının bölgedeki varlığı, çalışma alanından ilk defa bildirilmiştir (17). Aynı ön araştırmada, ilgili bölgede F. hepatica’nın ana ve doğal ara konağı olan Galba truncatula varlığı da bildirilmektedir. Bu çalışmada, örneklerin sahadan toplanması aşamasında L. stagnalis türü su salyangozunun akıntının olmadığı, suların sığ ve çamurlu olduğu bölgelerde yoğunlaştığı fark edilmiştir. Bu bilginin benzer çalışma yapmak isteyen araştırmacılara örnek toplama aşamasında yardımcı olabileceği düşünüldüğünden, ayrıca belirtme ihtiyacı duyulmuştur.

Fransa, İspanya, Portekiz, İsviçre, Almanya, Slovenya, Fas, Bolivya ve Venezuela’da yürütülmüş olan araştırmalara bakıldığında F. hepatica’nın ana ara konağının Galba truncatula olduğu görülmektedir (23-27). Malekzadeh-Viayeh ve ark. (13) tarafından yapılan bir çalışmada İran’da L. stagnalis türü su salyangozlarında F. hepatica’nın larval dönemlerinin moleküler yöntemlerle araştırılması sonucunda %1,1’lik bir enfeksiyon oranı tespit edilmiştir. Daha önce F. hepatica’nın ülkemizdeki varlığı ile ilgili yapılmış olan çalışmalara bakıldığında, araştırmaların daha çok son konakta kan, dışkı ve post mortem karaciğer muayenesi üzerinde yoğunlaştığı açık bir şekilde görülmektedir (28-30). Yapılan literatür taramalarında, daha önce ülkemizde F. hepatica’nın ara konağı olabilecek potansiyeli taşıyan bir su salyangozu hakkında moleküler prevalans çalışmasının yapılmadığı görülmüştür. Bu nedenle Ağrı ili civarında toplanan su salyangozu L. stagnalis’te, F. hepatica’nın larval aşamalarının moleküler bir yöntem olan PZR ile tespit edilmesi, ülkemizde bu konuda yapılmış bir ilk çalışma olma özelliğini de göstermektedir.

Ağrı ilinde Saltan ve Taşçı (30) tarafından yürütülen bir araştırmada kesime gönderilmiş 200 sığırın karaciğer ve safra yolları incelenmiş ve 47 sığırın safra yolunda F. hepatica’nın erişkin formuna rastlanılmıştır. Aynı çalışmada 188 adet sığırdan elde edilen dışkı ve kan örnekleri sedimentasyon ve ELISA yöntemleri ile incelemeye tabi tutulmuştur. Sonuç olarak 148 (%78,7) adet sığır ELISA testinde pozitif saptanmış ve 63 (%33,5) adet sığır dışkısında da F. hepatica yumurtalarına rastlanılmıştır. Ağrı ilinde F. hepatica’nın son konaktaki varlığının sabit olduğu göz önüne alındığında, bu çalışma potansiyel olarak ara konak olma özelliği taşıyan tatlı su salyangozlarında da F. hepatica’nın larval dönemlerinin araştırılmasının hastalıktan koruma programlarının daha iyi oluşturulabilmesi ve uygulanabilmesi açısından önemini ortaya çıkarmaktadır. Ayrıca, parazitle mücadelede ara konak olan su salyangozlarının sayısını azaltmak amacıyla kimyasal ve mollusit kullanımı dahil olmak üzere en önemlisi daha çevreci olan çeşitli biyolojik mücadele yöntemleri ve çevresel-ekolojik yönetim uygulamalarının yapılması tavsiye edilmektedir (31).

SONUÇ

Ağrı ili civarından toplanan tatlı su salyangozu L. stagnalis’te F. hepatica’nın larval dönemlerinin varlığını belirlemek amacıyla yapılan moleküler prevalans araştırması sonucunda iki (%1,3) adet su salyangozunda, trematod parazitin varlığı PZR yöntemi ile tespit edilmiş ve L. stagnalis türüne ait su salyangozlarının, F. hepatica’ya ara konaklık yaptığı saptanmıştır. Lymnaeid su salyangozlarının F. hepatica’nın larval formlarına ev sahipliği yaptığı düşünüldüğünde, fascioliasis’in yaygın olduğu bölgelerde ara konak ile mücadelede ekolojik dengeyi bozmayacak ve çevreyi kirletmeyecek mücadele yöntemlerinin uygulanmasının önemi ortaya çıkmaktadır.

* Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışma için etik kurul onayına gerek yoktur.

Hasta Onayı: Bu çalışma için hasta onamına gerek yoktur.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: A.H.Ü., R.Y., Dizayn: A.H.Ü., Veri Toplama veya İşleme: R.Y., A.H.Ü., Analiz veya Yorumlama: S.A., A.E., A.H.Ü., Literatür Arama: S.A., A.E., R.Y., A.H.Ü., Yazan: A.H.Ü., S.A., A.E.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek bildirilmemiştir.