GİRİŞ

İnsan ve hayvan sağlığı için önemli olan leishmaniasis, Leishmania cinsine ait parazitlerin neden olduğu zoonotik/antroponotik karakterli bir enfeksiyon hastalığıdır. Dünya genelinde 102 ülke ve bölgede endemik olarak görüldüğü bilinmektedir. Dünya Sağlık Örgütü’nün ihmal edilen hastalıklar listesinde bulunan leishmaniasis, tropikal hastalıklar listesinde sıtmadan sonra ikinci sırada bulunmaktadır. Hastalık farklı Leishmania türüne ve konağın immün sistemine bağlı olarak kutanöz leishmaniasis (KL), mukokutanöz (MKL) ve visseral leishmaniasis (VL) olmak üzere üç klinik formu bulunmaktadır (1,2). Türkiye’de KL olgularına, başta L. tropica olmak üzere L. infantum, L. major ve L. donovani’nin neden olduğu Güneydoğu Anadolu Bölgesi, Ege, Akdeniz ve Orta Anadolu Bölgeleri’nde, VL’ye ise başta L. infantum olmak üzere ve nadiren L. donovani ile L. tropica’nın neden olduğu sporadik olgular şeklinde daha çok Akdeniz ve Ege Bölgeleri’nde rastlanmaktadır. Son yıllarda KL olgu sayılarında görülen artışın önemli oranda küresel iklim değişikliği, seyahat etmenin kolaylaşması ve diğer endemik ülkelerden Türkiye’ye göç nedeniyle olduğu düşünülmektedir (3).

KL’de ilk lezyon, genellikle 2 cm çapa kadar küçük kırmızı bir papül şeklinde başlamaktadır. Birkaç hafta içinde papüller koyulaşır, kenarları kabarık ve merkezi kraterlere sahip ülserlere dönüşür. Lezyonlar genellikle derinin açıkta kalan bölgelerinde, özellikle yüz ve ekstremitelerde görülür. Lezyonlar ağrısızdır, yaklaşık bir yıl içinde kendiliğinden iz bırakarak iyileşir ve ömür boyu süren izler estetik açıdan sorun yaratır (4).

KL tanısında, klinik özellikler, laboratuvar testleri ve epidemiyolojik veriler tanı kriterlerini vermektedir. Aynı şekilde endemik bölgeye seyahat öyküsü ve endemik bölgede yaşamak da epidemiyolojik tanı kriterlerindendir (5). KL tanısında altın standart, lezyon bölgesinden alınan materyalden hazırlanan yayma preparatların Giemsa veya Wright boyama yöntemiyle incelenmesi sonucu direkt mikroskop inceleme veya alınan materyallerin NNN besiyerine ekilerek yapılan kültür yöntemleridir (6). Basit olmasına rağmen direkt mikroskop inceleme yönteminin kronik olgularda duyarlılığı düşüktür (7). Kültür yöntemleri, parazitemi oranlarının düşük olduğu durumlarda boyama yöntemi ile gözden kaçabilen parazitin üremesi ile tanının daha rahat konulmasını mümkün kılmaktadır (4).

Bu çalışmada, KL tanısında altın standart NNN besiyeri olmadığı durumlarda parazitlerin uzun süreli canlılığını koruyan ve hemen hemen tüm laboratuvarlarda bulunan bileşenlerden oluşan Leishmania türlerinin izolasyonu ve teşhisi için RPMI-1640 besiyeri kullanımının uygun bir yöntem olup olmadığı tartışılmıştır.

OLGU SUNUMU

Bu çalışmada, Manisa Celal Bayar Üniversitesi Hastanesi Dermatoloji Polikliniği’ne başvuran KL şüphesi uyandıran lezyonlara sahip 25 yaşındaki erkek hastadan alınan deri lezyon örneği kullanılmıştır. Hastanın Manisa/Kula’da ikamet ettiği, ancak Nisan 2018-Ağustos 2021 tarihleri arasında Suriye/İdlib’de asker olarak görev yaptığı öğrenilmiştir. Hastanın dermatolojik muayenesinde sağ ayak birinci proksimal metatarsofalangeal eklem ve sağ ayak bileği üzerine lokalize boyutları 2x2 cm ve 1x1 cm arasında değişen 2 adet etrafı ödemli, eritemli, ülsere plak izlenmiştir (Şekil 1). Lezyonun bulunduğu bölge %70 alkol ile temizlenmiştir, kuruduktan sonra sağlam doku ile lezyonun birleşme sınırından iğne ucu yardımıyla açılan kısımdan çıkan seröz sıvı alınarak yayma preparat hazırlanmıştır. Ardından oda ısısında kurumaya bırakılan preparatlar metil alkol ile 2-3 dakika tespit edilmiştir ve Giemsa ile boyanarak mikroskop altında (x1000) Leishmania spp. amastigotlarının varlığı açısından değerlendirilmiştir. Hastanın lezyonlarından seröz sıvı alınarak rutin besiyeri olarak kullanılan NNN besiyeri yerine RPMI-1640 sıvı besiyerine ekim gerçekleştirilmiştir. Bunun için lezyonların bulunduğu bölgeler %70 alkol ile temizlendi ve kurumaya bırakılmıştır, sağlam doku ile lezyonun birleşme sınırı baş ve işaret parmağı arasında tutularak iğne ucu yardımıyla seröz sıvı çıkarılmıştır. Bu seröz sıvı, içerisinde 2 mL RPMI-1640 sıvı besiyeri olan tüplere ekilmiştir ve tüpler 10 gün boyunca 26 °C’de inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrasında günaşırı besiyerleri kontrol edilerek promastigot varlığı açısından değerlendirilmiştir (Şekil 2). Hastanın lezyonlarından alınan seröz sıvısından DNA izolasyonu için High Pure PCR Template Preparation Kit (Roch®, Germany) kit prosedürüne uygun olarak yapılmıştır. Bu amaçla Leishmania spp. parazitlerinin SSU-rRNA ve 5.8S rRNA’sını kodlayan genleri ayıran ITS1 (Ribozomal Internal Transcribed Spacer 1) bölgesini hedefleyen primerler ve problar kullanılarak çoğaltılmıştır (8).

Çalışmamızda, KL şüpheli hastanın lezyonlarından elde edilen seröz sıvıdan hazırlanan Giemsa boyalı yayma preparatlarda Leishmania spp. amastigotları görülmüştür. Yapılan ekim sonrasında RPMI-1640 sıvı besiyerinde promastigotlar üretilmiş (Şekil 3) ve qPCR ile izolat L. tropica olarak tanımlanmıştır (Şekil 4). Leishmania tropica promastigotlarının RPMI-1640 sıvı besiyerinde en erken üçüncü günde üremeye başladığı saptanmıştır.

TARTIŞMA

Leishmaniasis, insan-vektör-insan geçişi ile yayılan, dünyada ülkemizin de içinde olduğu tropikal/subtropikal iklim kuşağındaki ülkelerde geniş bir alanda görülebilen önemli halk sağlığı sorunlarından birisidir. Endemik bölgede yaşayan bir milyardan fazla insan leishmaniasis açısından risk altındadır (9). KL tanısında en sık kullanılan yöntem lezyon kenarından enjektör yardımıyla alınan örneğin Giemsa veya Wright ile boyanması ve amastigot formlarının görülmesidir. Mikroskop inceleme yöntemi basit ve hızlı tekniktir, ancak özellikle kronik lezyonlarda duyarlılığı düşüktür (10). Kesin tanı, kültür yöntemleri kullanılarak promastigot formlarının üretilmesi veya klinik örneklerde parazitin amastigot formlarının gösterilmesiyle konulmaktadır. Leishmaniasis tanısında bu yöntemler “altın standart” olarak kabul edilmektedir (11).

Tanıda yaygın olarak kullanılan besiyerleri, defibrine tavşan kanı ve agar içeren NNN, pepton, agar ve sığır eti içeren modifiye Tobie besiyeri ve Schneider Drosophila besiyerleridir. Ayrıca piyasada bulunan M199 ve RPMI-1640 sıvı besiyerleri de oldukça sık kullanılmaktadır. Sıvı besiyerleri genellikle FCS, serum veya kan lizatları ile zenginleştirilmektedir. Ancak son yıllarda kontaminasyonu azaltmak, basit ve ucuz besiyeri hazırlamak için serumsuz ve otoklavlanabilir besiyerleri üzerine yapılan çalışmalar ön plana çıkmaktadır (4,12). Besiyeri kullanarak farklı Leishmania türlerinin morfolojisini, biyokimyasal analizini, enfektivitelerini, immünolojisini ve moleküler özelliklerini değerlendirmek mümkündür. Besiyeri çalışmalarında NNN ve ticari besiyerlerinin yanı sıra çeşitli maddeler kullanılarak farklı kültür besiyerleri hazırlanmış ve Leishmania spp. promastigotlarının üretiminde çeşitli yöntemler kullanılmıştır (4,13). Fakat NNN besiyerinde tavşan kanı kullanılması, hazırlanmasının zor ve zaman alması, kontaminasyon riski olması gibi dezavantajları bulunmaktadır (12). Bununla birlikte Leishmania izolatları ile yapılacak birçok çalışma için kısa sürede çok sayıda promastigot üreten sıvı kültür besiyerlerine ihtiyaç duyulmaktadır.

Hastadan alınan iğne aspirasyon sıvısı örneği ile yapılan Giemsa boyalı yayma preparatta Leishmania spp. amastigotlarının görülmesi ve besiyerinde promastigotların görülmesi KL tanısında altın standart olup en çok tercih edilen yöntemdir (10). Bizim olgumuzda da direkt mikroskobi ve kültür ile tanı konmuş ve qPCR ile yapılan tür ayrımı sonucunda etken L. tropica olarak saptanmıştır.

Aksoy Gökmen ve ark.’nın (12) çalışmalarında, tek fazlı sıvı besiyeri (nutrient buyyon) Leishmania spp. kültürü için kullanılmış ve RPMI-1640 sıvı besiyeri ile NNN besiyerlerine göre daha az başarılı olduğu bildirilmiştir. Bizim çalışmamızda ise, KL tanısında NNN besiyeri olmadığı durumda ona alternatif olabilecek RPMI-1640 sıvı besiyeri kullanılmış ve ekimin 3. günden itibaren de Leishmania spp. promastigotları tespit edilmiştir.

Limoncu ve ark.’nın (14) çalışmalarında, içerisine maya ekstresi, pepton ve %10 FCS ilave edilmiş P-Y adı verilen sıvı besiyeri, NNN ve %10 FCS ilaveli RPMI-1640 besiyerleri L. tropica ve L. infantum promastigotlarının çoğalması açısından karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak P-Y besiyerinin, %10 FCS ilaveli RPMI-1640 besiyerine ile benzer sonuçlar verdiği saptanmıştır. Çalışmamızda, parazitoloji ve mikrobiyoloji laboratuvarlarında kolaylıkla bulunabilen hızlı ve kolay hazırlanan RPMI-1640 sıvı besiyeri kullanılmıştır. RPMI-1640 sıvı besiyeri, promastigotların üretilmesi ve hastadan promastigot izolasyonu için kullanılmıştır. Bu besiyeri, bifazik NNN besiyerine alternatif bir seçenek olarak rapor edilmiştir.

Sonuç olarak bu çalışmanın, leishmaniasis tanısında kolay ulaşılabilen ve altın standart NNN besiyerinin temin edilemediği laboratuvarlarda alternatif besiyeri önermesi açısından önemli olduğu düşünülmektedir. Parazitoloji laboratuvarlarında kolay bir şekilde temin edilen ve hazırlanan RPMI-1640 sıvı besiyeri, hastalık tanısının konulması ve tedavi takibi, Leishmania spp. izolasyonu ve ilaç direnç çalışmaları gibi konularda yardımcı olabilir.

TEŞEKKÜR

Çalışmada Leishmania tropica izolatının kriyoprezervasyonunu sağlayan Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazit Bankası’na teşekkür ederiz.

Bilgilendirme: Uluslararası 22. Parazitoloji Kongresi’nde poster olarak sunulmuştur.

*Etik

Hasta Onayı: Hastanemizin polikliniklerine başvuran her hastadan onam formu alındığı için bu çalışma için ayrıca hasta onamı alınmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

*Yazarlık Katkıları

Cerrahi ve Medikal Uygulama: A.Ö., M.T.Ş., Konsept: A.Ö., M.T.Ş., Dizayn: A.Ö., Veri Toplama veya İşleme: İ.Ç., T.A., A.Y., M.T.Ş., Analiz veya Yorumlama: A.Ö., M.T.Ş., Literatür Arama: İ.Ç., T.A., A.Y., Yazan: İ.Ç., T.A., A.Y.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.