GİRİŞ
İnsanlara Eski Dünya’da Phlebotomus sp., Yeni Dünya’da ise Lutzomyia sp. cinsi dişi yakarcaların ısırmasıyla bulaşan ve Leishmania cinsi kamçılı protozoonların neden olduğu leishmaniasis, klinikte kendini deri (kutanöz), iç organ (viseral) veya deri ve mukoza (mukokutanöz) tutulumuyla gösteren paraziter bir hastalıktır (1). Kala-Azar ya da diğer adıyla viseral leishmaniasis (VL) hastalarında karaciğer ve dalağın yoğun parazit tutulumu nedeniyle büyüdüğü, ayrıca çeşitli semptom ve bulgular ortaya çıktığı, tanı ve tedavinin geciktiği olgularda klinik tablonun ağırlaşıp ölümle sonuçlanabildiği gözlenebilmektedir (1,2). Nitekim Dünya Sağlık Örgütü leishmaniasis’i, iç organ tutulumunda ölümcül olabilmesi ve tüm dünyada yaygın enfeksiyona neden olup geniş kitleleri risk altında tutması nedeniyle öncelikli enfeksiyonlar arasında saymaktadır (3). Ülkemizin de içinde yer aldığı Eski Dünya olarak tanımlanan bölgelerde VL L. donovani ve L. infantum türleriyle ortaya çıkmaktadır (4,5). Son yıllarda dünyanın farkı bölgelerinde yürütülen çalışmalarda, Leishmania türlerinin vektörlerinin dağılımındaki coğrafi değişikliklere ve değişen doğa koşullarına uyum için kendi aralarında genetik madde alışverişi yapabildikleri gösterilmiştir (6-8). Örneğin, L. infantum/L. major hibridlerinin yaşam döngülerini doğada yaygın bulunan ve insan enfeksiyonlarına sık yol açan Phlebotomus papatasi’de tamamlayabildiği, oysa L. infantum’un tek başına P. papatasi’ye yerleşemediği gözlenirken L. braziliensis/L. peruviana hibridlerinin doğaya daha iyi uyum sağladığı ve sağkalım oranlarının arttığı bildirilmiştir (9-11). Hibridleşen Leishmania’ların yeni vektörlere ulaşmasıyla daha yaygın coğrafyalarda insan enfeksiyonlarına yol açabileceği gibi, insanlarda tedaviye dirençli, deriden iç organlara yayılım gösterebilen ağır klinik tablolar oluşmasından da endişe edilmektedir (9). Nitekim son yıllarda, dünyada ve ülkemizde hibrid Leishmania izolatları vektörlerden olduğu kadar hastalardan da izole edilmeye başlanmıştır (7,11-13). Bu nedenle, özellikle klinik olgulardan izole edilen ve hibrid olduğu saptanan Leishmania türlerinin ayrıntılı moleküler, genomik ve proteomik araştırmalarla karakterize edilmesi, epidemiyolojik açıdan toplum sağlığı açısından taşıdıkları riskin ortaya konulabilmesi için önem taşımaktadır.
Leishmaniasis ile ilgili çalışmalarda farklı hayvan modelleri üzerinde enfeksiyonun klinik etkileri değerlendirilebilmekte, patogenez, immün cevap ve tedavi yanıtı konularında çalışmalar yürütülebilmektedir. Leishmania parazitlerinin canlı dokulardaki patojen etkilerinin Balb/C fareler gibi deney hayvanı modellerinde oluşturduğu histopatolojik değişikliklerle izlenmesinin, klinik tablonun ciddiyetini tahmin etmede yararlı olduğu bildirilmektedir (14,15). Leishmaniasis sonrası parazitlerin konak dokusundaki yerleşimi ve neden oldukları histopatolojik değişimler farklı çalışmalarda immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak gösterilmiştir. Karaciğer ve dalak dokularındaki amastigotların boyanması ile doku yoğunlukları, karaciğerde parazite karşı gelişen granulomların oluşumu, genişlikleri, bazı yüzey proteinlerinin boyanması ile de hücre tiplerinin analizi mümkün olabilmektedir (15). Ayrıca, farklı Leishmania türleriyle oluşan enfeksiyona bağlı yapısal değişiklikler de (örneğin, dalak dokusundaki damarlaşma veya bozunmalar) bu yöntemle incelenebilmektedir (16). Nitekim, Balb/C farelerde enfeksiyonun başlangıcından 4. haftaya kadar olan sürede karaciğerde parazit artışı görülüp sonraki günlerde azalmaktayken dalak dokusunda ise parazit varlığının 4. haftadan sonra da uzun bir süre devam ettiği gözlenmiştir. Ayrıca, Balb/C farelerde parazite özgü dalak CD4+ T ve CD8+ T-hücrelerini içeren hücresel immün yanıt ve karaciğerdeki granülom oluşumu ile viseral enfeksiyonun kontrol altına alındığı belirlenmiştir (17-19).
Fare modelinde enfeksiyona bağlı organlardaki patolojik değişikliklerin tanımlanıp sınıflandırılmasında hematoksilen-eozin boyalı doku kesitlerinin puanlanmasının mümkün olduğu bildirilmektedir (15). Karaciğerdeki yapısal değişiklikler; lezyonda granülom oluşumu, bölgeye göç eden immün hücreler ve dokunun bozunması üzerinden; dalaktaki yapısal değişiklikler ise lenfoid atropi olması veya lenfoid reaktivite düzeyi üzerinden 0-3 aralığında derecelendirilebilmektedir (20).
Ülkemizde bir VL hastasından izole edilen ve yapılan ileri testlerle L.donovani/L.infantum hibridi olduğu belirlenen parazitin geniş çaplı karakterizasyonunun amaçlandığı bir TÜBİTAK projesi kapsamındaki bu çalışmada; L. donovani/L. infantum hibridinin L. donovani ve L. infantum referans suşlarıyla karşılaştırıldığı in vivo testler ve bunlarla ilişkili patolojik ve immünohistokimyasal incelemelerin sonuçları sunulmaktadır.
YÖNTEMLER
Olgu
Çalışma, Manisa’da yaşayan, 28 yaşındaki bir erkek hastadan izole edilen ve yapılan gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonrası erime eğrisi analizlerinde oluşan çift eğri sonrası Leishmania donovani/L. infantum hibridi olduğu tespit edilen “MHOM/TR/2014/CBVL-LI/LD” kodlu suş ile yürütülmüştür. Aile sağlığı merkezine üşüme titreme, yüksek ateş, gece terlemesi, halsizlik ve kas ağrısı yakınmalarıyla başvuran ve üst solunum yolu enfeksiyonuna yönelik tedavi verilen hastanın 1 hafta sonra yüksek ateşinin geçmemesi üzerine hastaneye yatırılması kararlaştırılmıştır. Burada yapılan incelemelerde hastada hepatosplenomegali (bilgisayarlı tomografide dalak 18,5 cm, karaciğer 18 cm) ve pansitopeni (lökosit 2,600/mm3; hemoglobin 9,7 g/dL; trombosit 62.000/mm3) geliştiği belirlenmiştir. Hastanın kemik iliği ve lenf bezi aspirasyon sıvılarından hazırlanan Giemsa ile boyalı preparatlarda Leishmania amastigotları saptanmış, NNN besiyerine ekilen aspirasyon sıvılarında da 6. günden itibaren Leishmania promastigotları görülmüştür. Bunun üzerine hastaya tedavi başlanmış ve kültürde çoğaltılan Leishmania’lar sıvı azotta -196 °C’ye kaldırılmıştır.
Kültür
Hibrid suş (MHOM/TR/2014/CBVL-LI/LD), karşılaştırma amacıyla kullanılacak referans Leishmania donovani (MHOM/IN/1980/DD8) ve L. infantum’un suşu (MHOM/TN/1980/IP-1) ile birlikte sıvı azottan çıkarılarak tarif edildiği şekilde çözdürülmüş (21) ve NNN besiyerine ekilmiştir. Üreme ilk olarak burada gerçekleştikten sonra kültürler çok sayıda promastigot eldesi için %10 fetal buzağı serumu içeren Rosswell Park Memorial Institute-1,640 besiyerine aktarılmıştır. Bu besiyerine ayrıca %1 penisilin-streptomisin (penisilin, 10,000 units/mL-streptomisin, 10 mg/mL) ve %0,2 gentamisin (gentamicin, 50 mg/mL) eklenmiştir. Ekim sonrası kültürler 25 °C’lik etüvde inkübe edilmiştir.
Çalışma Gruplarının Oluşturulması
In vivo VL modeli oluşturabilmek için, etik kurul onayı sonrası (ACU-HADYEK 2018/09) Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Merkezi’nde dişi, 5-7 haftalık ve 20-25 gr ağırlığında toplam 56 Balb/C fare ile çalışma yapılmıştır. Bu farelerin (Leishmania infantum grubu, Leishmania donovani grubu ve L. infantum/L. donovani hibrid grubunda 16’şar fare olmak üzere) toplam 48’i çalışma gruplarında, 8’i ise kontrol grubuna alınmış, deneylerin sonuna kadar ad libitum beslenmişlerdir.
Farelerin Enfekte Edilmesi
Kültürde çoğaltılmış üç farklı suşa ait Leishmania promastigotları, son konsantrasyon 1x108 promastigot/mL olacak şekilde hazırlanmış ve çalışma gruplarındaki farelerin kuyruk venlerine 15 µL uygulanmıştır. Tüm fareler enjeksiyon sonrası VL’ye bağlı beklenen olası değişiklikler (örneğin; kilo kaybı, tüylerde dökülme, hareketlerde yavaşlama) yönünden izlenmiştir. Ayrıca, enfeksiyonun farelerde yerleştiğini gösterebilmek amacıyla çalışmanın 21. günü farelerden kan alınıp 4 °C ve 3,000 RPM’de 10 dakika santrifüjlenmiş ve özgün Leishmania IgG ELISA kiti (Qualitative Mouse Leishmania antibody IgG ELISA Kit, MyBioSourceTM) ile araştırılmıştır.
Farelerin Sakrifiye Edilmesi
Enfeksiyonun 21. günü alınan kan örneklerinden yapılan ELISA testiyle farelerin enfekte olduğu tespit edildikten sonra tüm farelerin yarısı enfeksiyonun karaciğerde en yüksek seviyeye ulaştığı 30. günde ve daha sonra 60. günde karbonmonoksit koklatma yöntemiyle sakrifiye edilmiştir (14,15). Sakrifikasyondan hemen önce farelerin kalplerinden 0,1 mL kan alınıp saklanmış, sakrifikasyon sonrası ise tüm farelerin dalak ve karaciğerleri diseke edilerek proje kapsamındaki diğer testler için (immünohistokimya, DNA ve RNA izolasyonu ve akışlı sitometri çalışmaları) kullanılmak üzere parçalanarak ayrılmıştır. Çalışma grubundaki farelerin karaciğer ve dalaklarında parazit varlığını göstermek için, bu organlardan ayrıca örnekler alınarak NNN besiyerine ekilmiş ve besiyerleri 25 °C’lik etüvde inkübe edilmiştir.
İmmünohistokimya Çalışmaları İçin Dokuların Alınması
İmmünohistokimya çalışmalarında kullanılmak için çalışmanın 30. ve 60. günlerinde sakrifiye edilen toplam 56 farenin her birinden 20 mg dalak doku parçası ve 35 mg karaciğer doku parçası, %10 formol içeren steril biyopsi kapları içerisine konulmuştur.
İmmünohistokimyasal Analizlerin Yapılması
Sakrifiye edilen farelerin karaciğer ve dalaklarından “touch biopsy” ile yaymalar hazırlanmış, enfeksiyona bağlı patolojik değişikliklerin gruplarda karşılaştırmalı tespiti için immünohistokimyasal boyalarla boyanması gerçekleştirilip histopatolojik incelemeler yapılmıştır. Her bir farenin karaciğer ve dalak dokularından alınan örnekler rutin histopatolojik inceleme için hazırlanmış, rutin hematoksilen eozin boyası uygulanarak değerlendirilmiştir.
Karaciğer ve dalakta oluşan yapısal değişikliklerin değerlendirilmesinde, önceki bir makalede (15) kullanılan ve Tablo 1’de gösterilen puanlama dikkate alınmıştır.
Dokularda VL’ye bağlı oluşan hasarın derecesini ve niteliklerini ortaya koyabilmek ve fibrozis gelişimi yönünden değerlendirmek için histokimyasal olarak masson trikrom boyası; immünohistokimyasal olarak interlökin-9; enflamatuvar hücre tiplerinden mast hücrelerine yönelik CD117, eozinofiller için anti-MBP, monosit-makrofajlar için CD163, T lenfositler için CD4 ve CD8, endotel hücreleri için CD31 uygulanmıştır.
İstatistiksel Analiz
Çalışma kapsamında sonuçların yorumlanması için istatistiksel analiz gerekmediğinden herhangi bir yönteme başvurulmamıştır.
Etik Kurul Onayı
Bu çalışma, Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulu’nun 18.01.2018 tarihli ve HDK 2018/09 nolu kararı uyarınca etik açıdan uygun bulunmuştur. Çalışma için hasta önceden bilgilendirilmiş ve onayı alınmıştır.
BULGULAR
Yapılan patolojik incelemelerde; hibrid suş, L. infantum ya da L. donovani ile enfekte farelerin hiçbirinde dalak ya da karaciğerinde makroskopik bir patolojiye (örneğin, boyutlarda genişleme) rastlanmadığı bildirilmiştir. “touch biopsy” sonrası yapılan mikroskobik incelemelerde de, karaciğerde ya da dalakta hematoksilen-eozin boyama sonrası Leishmania amastigotlarına yine hiçbir grupta rastlanılmamıştır (Şekil 1).
Masson trikrom boyası ile yapılan incelemelerde, hibrid suş, L. infantum ya da L. donovani ile enfekte farelerin hiçbirinin dalak ya da karaciğer dokularında fibrozis gelişimi yönünden herhangi bir bulgu gözlenmemiştir. İç organ tutulumunu göstermek amacıyla yapılan immünohistokimyasal testlerle de deney grubundaki farelerin hiçbirinde patoloji yönünden anlamlı bir boyanmaya rastlanılmamış, tüm değerlendirmelerde puanlama sıfır olarak belirtilmiştir (Şekil 2, 3, 4).
TARTIŞMA
Leishmaniasis, ülkemizin de içinde olduğu tropikal ve subtropikal iklim kuşağındaki ülkelerde önemli halk sağlığı sorunlarından biri olmaya devam etmektedir. Değişen çevre koşullarına uyum sürecinde Leishmania türleri arasında genetik madde alışverişine bağlı hibrid türler oluştuğu dünyanın farklı bölgelerinden bildirilmektedir (6,7). Hibrid türlerin tanı yöntemleriyle saptanamayan ve/veya tedaviye yanıt vermeyen ağır klinik tablolara yol açma riski nedeniyle saptanıp araştırılmalıdır (3,9).
VL büyük oranda L. donovani ve L. infantum’un etken olduğu ve hastalara etkin tedavi uygulanmadığında ölümcül olabilen bir enfeksiyondur. Tüm dünyada görülen olguların %90’ının Bangladeş, Brezilya, Hindistan, Nepal ve Sudan’da görüldüğü bildirilmekte, ülkemizde de halk sağlığını tehdit edecek salgınlara yol açabileceği belirtilmektedir (1-3). Enfeksiyon sırasında Leishmania amastigotlarının dalak ve karaciğerden başlayarak iç organların mononükleer fagositer hücrelerine yayıldığı gözlenmektedir (22).
Hastalarda VL patogenezi ve oluşan immün yanıt ile ilgili çok sayıda bilinmeyen nokta bulunmaktadır. Bu yöndeki araştırmalar için deney hayvanı modelleri oluşturulmakta, bunun için kolayca sağlanabilen fareler sıklıkla tercih edilmektedir (8,23). Ayrıca, aynı türden olan fareler genetik olarak özdeş olduklarından farelerle çalışarak nesiller boyu genetik veri toplayıp belirli bir fenotipe yönelik karakterizasyon yapmak da mümkün olabilmektedir (8). Yine de VL çalışmaları için geliştirilmiş farklı hayvan modelleri olmakla birlikte, bunların hiçbirinin insandaki enfeksiyonu başarıyla taklit edebildiği söylenememektedir; deney hayvanları ile oluşturulan modellerden alınacak sonuçların insanlarda ortaya çıkan klinik tabloyla uyumlu olmayabileceği de unutulmamalıdır (4,24).
Deney hayvanlarında VL modeli oluşturmanın hayvanın cinsine, genetik alt yapısına, verilen parazit miktarın ve uygulama yoluna bağlı olabileceği belirtilmektedir (1,3). Balb/C farelerde VL modeli oluştururken organa özgü bir immün yanıt oluştuğu bildirilmektedir (8,17). Enfeksiyonun ilk haftalarında parazitler karaciğerde hızla çoğalmakta, 4. haftadan sonra geliştiği bildirilen yardımcı T-hücre (Th1) cevabına bağlı olarak karaciğerdeki parazitlerin ortadan kalktığı ve re-enfeksiyona direnç geliştiği gözlenebilmektedir (8,25). Karaciğerdeki enfeksiyon sınırlılık gösterirken dalakta çok daha uzun süre kaldığı ve splenomegalinin devam ettiği tespit edilmiştir (26). Balb/C farelerde VL enfeksiyonu sırasında parazit yükü kontrol altında tutulmakla birlikte paraziteminin 8. haftada zirveye çıktığı bildirilmektedir (4). Araştırmacılar, Balb/C farelerin VL’ye ait subklinik tabloların araştırılması, enfeksiyon sırasındaki immünopatolojik değişikliklerin izlenmesi ve aşı çalışmaları için uygun olduğunu belirtmektedir (4,8). Biz de, gerek deney hayvanı laboratuvarımızda kullanabileceğimiz en uygun model olarak, gerekse immün cevabı kolayca izleyebilmek amacıyla bu çalışmada Balb/C fareler ile çalışmayı tercih ettik. Çalışma öncesi hedefimiz, L. donovani ve/veya L. infantum ile enfekte edilmiş farelerde en azından 30. gün karaciğer ve dalaktan hazırlanan yayma preparatlarda ve/veya immünohistokimyasal analizlerde patolojik değişiklikler görmekti. Çalışmanın 60. günü karaciğerdeki patolojinin ortadan kalkmış olabileceğini, ancak dalakta süreceğini tahmin ediyorduk. Nitekim başta, çalışma gruplarındaki farelere kuyruk veninden enjekte edilen Leishmania promastigotlarının dalak ve karaciğere ulaştığı, gerek ELISA testiyle gerekse sakrifiye edilen hayvanlardan alınan karaciğer ve dalak dokularının kültüre eklenmesi sonrası 5. günden sonra mikroskopta görülen Leishmania promastigotlarıyla gösterilmişti. Bununla birlikte, deneyin 30. ve 60. günlerinde sakrifiye edilen çalışma grubundan hiçbir farede karaciğer ya da dalakta immünohistokimyasal bir patolojiye rastlanılmadı. Çalışma gruplarındaki farelere ait enjeksiyon sonrası gözlem notlarımızda da herhangi bir anormallik (örneğin; kilo kaybı, hareketlilikte azalma, tüy dökülmesi) kaydedilmemişti. Bu durum, farelerin Leishmania’lara karşı etkin bir Th-1 yanıtı geliştirmediğini, karaciğer ve dalakta enfeksiyonun ya hiç gelişmediğini ya da gelişip 30. günden önce iyileştiğini düşündürmektedir. Bu çalışmada kullanılan Leishmania suşlarıyla benzer özelliklerdeki Balb/C farelerin tümünde deri altına uygulanan aynı dozda promastigotlarla kutanöz leishmaniasis’e ait deri lezyonu oluştuğu gözlenmiştir (Kurt Ö, yayınlanmamış veri). Ayrıca, önceki çalışmalarda benzer doz ve yolla Balb/C farelerde L. donovani ile VL modeli oluşturulduğu da bilinmektedir (4,5,8). Üstelik yüksek doz Leishmania promastigotlarının farelere damar yoluyla verilmesiyle dalak ve karaciğerde uzun süreli tutulum sağlandığı da belirtilmiştir (15). İmmün cevaba yönelik deneyler tamamlandığında, karaciğer ve dalaktaki sitokin ve antikor düzeyleri üzerinden, çalışmaya ait tüm veriler birlikte tekrar değerlendirilecektir.
SONUÇ
Ülkemizde ilk kez klinikte yatan bir VL hastasından izole edilen L. donovani/L.infantum hibridinin karakterizasyonuna yönelik kapsamlı bir projeye ait bu ilk çalışmada, deney modeli olan Balb/C farelerde Leishmania suşlarının karaciğer ve dalağa ulaşabildiği ancak oluşan enfeksiyonun patolojik değişikliklere yol açmadığı gözlenmiştir. Hibrid suşun farelerde oluşturduğu immün yanıtın ölçümüne yönelik ayrıntılı testlerin tamamlanması sonrası sonuçlar daha geniş bir açıdan değerlendirilecektir.
*Etik
Etik Kurul Onayı: Bu çalışma, Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulu’nun 18.01.2018 tarihli ve HDK 2018/09 no'lu kararı uyarınca etik açıdan uygun bulunmuştur.
Hasta Onayı: Çalışma için hasta önceden bilgilendirilmiş ve onayı alınmıştır.
Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.
* Yazarlık Katkıları
Konsept: Ö.K., Ü.İ., F.Y.Z., Dizayn: Ö.K., S.Ö.O., F.Y.Z., Veri Toplanma veya İşleme: D.E.K., S.Ö.O., E.M.A., N.M.Ö., C.K.K., Analiz veya Yorumlama: S.Ö.O., Ü.İ., Ö.K., Literatür Arama: D.E.K., S.Ö.O., M.A., N.M.Ö., Yazan: Ö.K., S.Ö.O.
Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.
Finansal Destek: Bu çalışma, TÜBİTAK tarafından desteklenen, 118S352 numaralı “Türkiye’de yerli bir viseral leishmaniasis olgusunda ilk kez tanımlanan Leishmania donovani/L. infantum hibridinin ayrıntılı genomik ve proteomik karakterizasyonu ile in vivo koşullardaki patojen etkilerinin ve oluşturduğu immün yanıtın fare modelinde L. donovani ve L. infantum’un referans suşlarıyla karşılaştırmalı analizi” isimli 1001 projesinden üretilmiş bir çalışmadır.