GİRİŞ

Kistik ekinokokkozis (KE), Echinococcus granulosus (E.granulosus) sensu lato'nun (s.l) larval formu tarafından oluşturulan insanları, çiftlik hayvanları ve yaban hayvanlarını etkileyen zoonoz karaktere sahip bir enfeksiyondur (1). KE, insanlarda önemli bir halk sağlığı sorunu olmasının yanı sıra çiftlik hayvanlarında verim kayıplarına yol açması bakımından önem arz etmektedir (2). Özellikle çiftlik hayvanlarının başlıca karaciğer ve akciğerleri olmak üzere diğer bazı iç organlarını etkilemekte, dolayısıyla hem canlı hayvanlarda verim kayıpları hem de enfekte organların imhası nedeniyle ekonomik kayıplara neden olmaktadır (3). Türkiye’de köpeklerde E. granulosus’un yaygınlığı %0,8-44 olarak belirlenirken, KE’nin yaygınlığının koyunlarda %3,5-70,91, sığırlarda %3-46,41 ve keçilerde ise %1,6-25,11 olduğu belirlenmiştir (4-6). Türkiye’de KE kaynaklı yıllık ortalama ekonomik kayıpların sığırlar için 32,4 milyon Amerikan doları (USD), koyunlar için 54,1 milyon USD ve keçiler için ise 2,7 milyon USD olduğu tahmin edilmektedir (7,8).

E. granulosus s.l., dünyanın hemen hemen her bölgesinde tespit edilmiş olup yapılan çalışmalarla geniş bir yayılışa sahip olduğu ortaya konmuştur (9). Başlangıçta E. granulosus, KE enfeksiyonunun nedeni olarak düşünülüyordu. Fakat son yıllarda yapılan moleküler ve taksonomik çalışmalar neticesinde beş kriptik türün bir kompleksi olan E. granulosus s.l’nun KE’nin sebebi olduğu kabul edildi. Bu türler; E. granulosus s.s. (G1 ve G3 genotipleri), E. equinus (G4), E. ortleppi (G5), E. canadensis (G6-10), ve E. felidis’dir (10,11). Türkiye’de E. granulosus s.s. (G1 ve G3), E. equinus (G4) ve E. canadensis (G6/7) olmak üzere üç Echinococcus türü mevcuttur. Türkiye’de yapılan genotiplendirme çalışmalarında E. granulosus s.s.’nun en yaygın tür olduğu ortaya konmuştur (8,12-14).

Türkiye'de at, eşek ve katırlarda KE'nin durumu hakkında yeterince çalışma yapılmadığı için eldeki veriler sınırlıdır (15). Ülkemizde şimdiye kadar gerek prevelans gerekse moleküler karakterizasyonun belirlenmesine yönelik çalışmalar kısıtlı sayıdadır (16). Türkiye’de tek tırnaklı hayvanlarda E. granulosus’un genotiplendirilmesi ile ilgili dört rapor bulunmaktadır (16). İlk olarak Utuk ve Simsek’in (15) yaptıkları çalışmada E. granulosus at izolatının moleküler karakterizasyonu yapılmış ve E. granulosus s.s. (G1-G3) tespit edilmiştir. Simsek ve Cevik (17) Türkiye’de bir katırda E. equinus’un ilk tespiti ve moleküler karakterizasyonunu yapmışlardır. Simsek ve ark. (14) Türkiye’de bir eşekte E. equinus’nin ilk raporunu bildirmişlerdir. Son olarak ise Kesik ve ark. (16) bir eşeğin karaciğerinde hidatid kist belirlemişler ve bunun E. equinus olduğunu DNA dizi analiziyle teyit etmişlerdir. Diğer taraftan Türkiye’de domuz ve yaban domuzlarında KE enfeksiyonu üzerine araştırma ve çalışma bulunmamaktadır. Sadece moleküler epidemiyoloji yönünden insan izolatlarında E. granulosus’un domuz suşu olan G7 genotipinin birkaç bildirimi söz konusudur (18,19). Yaban domuzu KE’nin silvatik döngüsünde önemli bir rol oynamakla beraber dünyanın farklı bölgelerinden de yaban domuzlarında E. granulosus enfeksiyonları bildirilmiştir (9).

Dünya'da tek tırnaklı hayvanlarda, domuzlarda ve yaban domuzlarında yapılan prevalans ve moleküler karakterizasyon çalışmalarına bakıldığında birçok çalışmanın mevcut olduğu görülmektedir (9). İtalya’da atlarda %1’den daha düşük bir KE yaygınlığı bildirilmiştir (20). Bunun yanında İtalya’nın Sardinya, Toskana ve Sicilya bölgelerindeki atlarda E. equinus (G4) belirlenmiştir (20,21). İtalya’nın farklı bölgelerindeki raporlara göre domuzlarda KE yaygınlığı %9,4-11 (22,23) iken yaban domuzunda bu oran %3,7 (24) olarak belirlenmiştir. Genotiplendirme çalışmalarında ise domuzlarda E. granulosus s.s. (G1) ve E. intermedius (G7) (23), yaban domuzunda ise E. granulosus s.s. (G1) bildirilmiştir (25). Ukrayna’da yaban domuzlarının KE prevalansı %5,2 olup moleküler karakterizasyon çalışmalarında ise iki domuz ve bir yaban domuzu izolatında E. intermedius (G7) bildirilmiştir (26). Fransa’da KE’nin yaygınlığı domuzlarda %5,9, yaban domuzlarında ise %4 olarak tespit edilmiş ve bu örnekler E. intermedius (G6/7) olarak genotiplendirilmiştir (27). Yunanistan’da domuzlarda KE %5 olarak tespit edilmiş (28) moleküler çalışmalar neticesinde yaban domuzlarında E. granulosus s.s. (G1) belirlenmiştir (29). Romanya’da yaban domuzlarında KE prevalansı %12,4 olarak tespit edilmiş ve bu örneklerin E. intermedius (G7) olduğu bildirilmiştir (30). İspanya’da atlarda E. equinus (G4), domuz ve yaban domuzlarında ise E. granulosus (G1) ve E. canadensis (G7) bildirilmiştir (31,32). İran’da tek tırnaklılarda yapılan çalışmalar neticesinde E. granulosus s.s. (G1), E. equinus (G4) ve E. canadensis (G6) türleri (33,34), Tunus’ta atlarda E. granulosus s.s. (G1), E. equinus (G4) (35,36), yaban domuzunda ise E. granulosus s.s. (G1) (35), Mısır’da atlarda E. equinus (G4) (37), domuzlarda E. canadensis (G6/G7) (38,39) tespit edilmiştir.

Bu çalışmada hidatid kist ile doğal enfekte olan bir yaban domuzu ve katırdan elde edilen kist materyalinin morfolojik ve moleküler karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Yaban domuzundan elde edilen kist hidatid materyalleri, yerel avcılar tarafından Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’na Erzincan’nın Kemaliye ilçesinden getirilen bir yaban domuzundan elde edilmiştir. Katır hidatid kist materyalleri ise; yine nekropsi için Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’na getirilen hayvandan elde edilmiştir. Tüm iç organlar olası hidatid kistlerin saptanması için inspeksiyon ve palpasyon yapılarak incelendi. Kist sıvısı steril enjektörler yardımı ile alınarak aspire edildi ve 5,000 rpm’de 5 dakika süreyle santrifüj edildi. Kist sıvısı, kist fertilitesi açısından ışık mikroskobu altında incelendi. Tüm kist materyalleri (germinal membranlar) moleküler analiz aşamalarında kullanılıncaya kadar %70’lik etil alkol içerisine alınarak -20 °C’de saklandı.

Çalışma günü derin dondurucudan çıkarılan örnekler bir bistüri yardımı ile küçük parçalara ayrılarak 1,5 mL’lik eppendorf tüplere aktarıldı. Üzerlerine 600 µL 1X PBS solüsyonundan eklenip en az 5 kez yıkandı. Akabinde 600 µL lysis buffer ve 20 µL proteinase-K (sigma, 20 mg/mL) eklenip, 1 gece 56 °C’de sıcak su banyosunda bekletildi. Ticari RTA genomik DNA izolasyon kit (RTA Lab. Türkiye) prosedürleri takip edilerek 100 µL gDNA elüsyonu elde edildi ve sonraki analizlere kadar -20 °C’de muhafaza edildi. Daha sonra gDNA’lar kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) amplifikasyonları yapıldı. Kesin suş/tür tayini amacıyla Bowles ve ark. (40) tarafından bildirilen spesifik primerler (5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’ ve 5’-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3’) kullanılarak mitokondrial sitokrom oksidaz subunit 1 (mt-CO1) gen bölgesi PZR ile çoğaltıldı. PZR ürünleri %1,4’lük agaroz jelde elektroforeze tabi tutulup görüntülendi. Amplifiye olan mt-CO1 PZR ürünleri jel pürifikasyon kiti (RTA genomik DNA saflaştırma kiti, Türkiye) ile saflaştırıldı ve IONTEK (İstanbul, Türkiye) firmasına tek yönlü DNA sekans analizi için gönderildi. Sekans sonuçları FinchTV 1,4,0 (Geospiza Inc. ©) yazılım programı ile görüntülendi ve nükleotid sekanslarının elektroferogram kalitesi, yanlış okumalar nedeniyle her iki uçtan kesimler yapılarak sonraki analizlere geçildi. Sekans sonuçları BLAST analizi yapılarak hizalandı ve hem yaban domuzu hem de katır sekansları Genbank’ta mevcut bulunan doğrulanmış (referans) sekanslar (MT072979, MN199126, MK321259, LC184604, KT382535, KC953029, EF558356, AB461420) ile karşılaştırıldı. MEGA X yazılım programı kullanılarak çoklu sekans hizalaması gerçekleştirildi ve yine MEGA X yazılım programı kullanılarak en uygun baz modeli olan HKY+G: “Hasegawa-Kishino-Yano model Gamma distribution (5 categories (+G, parameter =0,1387)” seçilerek filogenetik ağaç oluşturuldu (41). Bu çalışmada etik kurul onayına gerek yoktur.

İstatistiksel Analiz

Çalışmamız bir yaban domuzu ve katırda gerçekleştirilen moleküler karakterizasyon çalışması niteliğinde olduğundan herhangi bir istatistiksel analiz yapılmamıştır.

BULGULAR

Nekropsileri yapılan hayvanlardan yaban domuzunun ölüm nedeninin, av tüfeği ateşine bağlı kanama ve beyin travması olduğu, katırın ise yaşlılığa bağlı ötenazi yapıldığı ifade edilmiştir. Postmortem muayeneleri ve iç organların makroskobik incelemeler neticesinde yaban domuzunun akciğerinin diyafragmatik lobunda 1 cm çapında (Şekil 1), katırın ise karaciğer parankiminde yine 0,5-1 cm çapında hidatid kist saptandı. Mikroskobik incelemeler sonucunda kist sıvısı ışık mikroskobu altında olası protoskoleks varlığı yönünden kontrol edildi ancak protoskoleks tespit edilemediği için kistler steril olarak değerlendirildi.

Hidatid kist materyallerinin (germinal membranlar) gDNA izolasyonunun ardından mt-CO1 gen bölgesinin PZR amplifikasyonu gerçekleştirilip 446 bp’lik bant elde edildi (Şekil 2).

Hidatid kist izolatlarının mt-CO1 gen bölgesi kısmi sekansları GenBank’taki mevcut bulunan referans sekanslar ile hizalanarak karşılaştırıldı, yaban domuzu ve katır örneklerinin E. granulosus s.s. (G1) ile %100 benzerliğe sahip olduğu doğrulandı (GenBank veri tabanında kayıtlı accession numaraları: MT310971-MT276667) (Şekil 3).

TARTIŞMA VE SONUÇ

E. granulosus’un neden olduğu KE, hem insanları hem de hayvanları etkileyen kırsal alanlarda ve özellikle az gelişmiş ülkelerde sıklıkla görülen dünyadaki en önemli zoonozlardan biridir (42). E. granulosus içindeki suş farklılıkları etkenin konak spesifitesi, gelişim hızı, patojenitesi, antijenik özellikleri, kemoterapotiklere duyarlılığı, bulaşma dinamikleri ve epidemiyolojisinde farklılıklara yol açabilmektedir (43). Bu nedenle endemik bir bölgedeki baskın suş ve/veya suşların ortaya konması parazitin kontrolü ve olası eradikasyonu açısından oldukça önemlidir (44).

E. granulosus’un taksonomisi çeşitli moleküler düzeydeki çalışmalar kapsamında özellikle mt-CO1 DNA dizilerinin Echinococcus izolatlarına uygulanması ile Echinococcus türlerinin moleküler düzeydeki sınıflandırılması, genetiği, epidemiyolojisi ve fenotipik varyasyonu ile ilgili birçok bilgi elde edilmiştir (9). Örneğin; önceden E. granulosus’un at suşu (G4) olarak tanımlanan E. granulosus equinus son yıllarda yapılan klasifikasyon çalışmaları sonucunda tür bazında E. equinus olarak isimlendirilmiştir (44). Türkiye’de günümüze kadar yapılan Echinococcus türlerinin moleküler karakterizasyon belirleme çalışmaları neticesinde üç farklı türün sirkülasyonu bulunmaktadır. Bu türler E. granulosus s.s. (G1-G3), E. equinus ve E. canadensis (G6/G7) olarak bildirilmiştir (8,12,13,18,45).

İtalya’da Varcasia ve ark. (20), ülkenin Sardunya, Sicilya ve Toskana bölgelerinde toplamda 2,231 at üzerinde kist hidatid yönünden bir çalışma gerçekleştirmiş ve ND1, CO1 ve 12S gen bölgelerinin kısmi DNA sekans analizi sonuçlarına göre iki atta E. granulosus s.s. üç hayvanda ise E. equinus tespit etmişlerdir. Fransa’da benzer bir çalışmada ND1 ve CO1 gen bölgelerinin DNA sekans analizi sonuçlarına göre 11 atta E. equinus bildirilmiştir (32). Almanya’da bir kısrağın akciğerinden izole edilen kist hidatid, ND1 ve CO1 gen bölgelerinin DNA sekans analizi sonucunda E. equinus olarak tespit edilmiştir (46). Tunus’ta Echinococcus izolatlarının genetik çeşitliliği ve haplotipleri üzerine yapılan bir çalışmada eşeklerden elde edilen hidatid kistlerin cox1 ve ef1a gen bölgeleri PZR amplifikasyonuna tabi tutulduktan sonra DNA sekans analizleri yaptırılmış ve E. granulosus s.s. ve E. equinus türleri belirlenmiştir (35). Mısır’da eşeklerdeki E. granulosus’un moleküler karakterizasyonu üzerine yapılan bir çalışmada 145 eşek incelenmiş ve bunların 10’unda hidatid kist belirlenmiştir. Bu örneklerin ND1 ve CO1 gen bölgelerinin DNA sekans analizi sonucunda E. equinus (G4) olduğu rapor edilmiştir (37).

Türkiye’de nekropsisi gerçekleştirilen bir atta rastlanılan hidatid kistin moleküler karakterizasyonunu belirlemeye yönelik yapılan bir çalışmada öncelikle 12S rRNA gen bölgesinin PZR amplifikasyonu sonrasında mt-CO1 gen bölgesinin sekans sonuçlarına göre E. granulosus s.s. (G1-G3) olduğu ortaya konmuştur. (15). Başka bir çalışmada (17) bir katırda hidatid kist tespit edilmiş olup bu izolatın 12S rRNA ve mt-CO1 gen bölgelerinin PZR’si daha sonrasında mt-CO1 bölgesinin kısmi sekans analizi neticesinde Türkiye’de ilk defa bir katırda E. equinus raporu bildirilmiştir. Ülkemizde bir eşekte yapılan nekropsi sonucunda akciğer parankiminden izole edilen hidatid kist izolatının mt-CO1 ve NADH1 gen bölgelerinin sekans analizleri sonucunda Türkiye’de ilk defa E. equinus rapor edilmiştir (14). Diğer bir çalışmada bir eşeğin karaciğerinde hidatid kist belirlenmiş, 12S rRNA ve CO1 genlerinin PZR ve mt-CO1 geninin kısmi sekans analizleri ile moleküler karakterizasyonu yapılmış olup neticede E. equinus tespit edilmiştir (16).

Bu çalışmada ise bir katırın karaciğerine lokalize olmuş hidatid kiste rastlanmıştır. Mitokondriyal COI ve NAD1 gen bölgelerinin kısmi sekans analizleri Echinococcus türlerinin genotiplendirilmesi için oldukça spesifiktir. Bu sebeple bu çalışmada mt-CO1 gen bölgesi tercih edilmiştir. Elde edilen izolatların mt-CO1 gen bölgelerinin DNA dizi analizleri sonucunda E. granulosus s.s. (G1-G3) olduğu belirlenmiştir. Katırlar bu nedenle Echinococcus türlerinin bulaşma döngüsünde olası ek bir enfeksiyon kaynağı olabilirler.

Dünyada yaban domuzları ile ilgili çalışmalara bakıldığında baskın türün E. granulosus s.s. (G1 ve G3) ve E. canadensis (G7) olduğu görülmektedir (9). Ukrayna’da bir yaban domuzunun karaciğerinden elde edilen hidatid kist izolatının moleküler karakterizasyonunu belirlemeye yönelik yapılan bir çalışmada, mt-ND1 gen bölgesinin kısmi sekans analizi sonucunda E. granulosus’un G7 suşu bildirilmiştir (26). Fransa’da 19 domuz ve 4 yaban domuzunun mt-CO1 ve NADH1, ATP synthase subunit6 (atp6) ve NADH dehydrogenase subunit 3 (nad3) gen bölgelerinin sekans analizleri neticesinde E. canadensis (G6/G7) belirlenmiştir (27). İtalya’nın Latium bölgesinde iki yaban domuzunda kist hidatid belirlenerek öncelikle mt-CO1, nad1 ve rrnS (small subunit ribosomal RNA) gen bölgelerinin DNA sekans analizleri neticesinde örneklerde E. granulosus s.s. (G1) bildirilmiştir (25). İspanya’da 4 yaban domuzuna ait hidatid kist örneğinin üçünde E. canadensis (G7), birinde ise E. granulosus s.s.(G1) tespit edilmiştir (32). Türkiye’de ise domuz ve yaban domuzlarında prevalans ve moleküler karakterizasyon (genotiplendirme) çalışmaları oldukça kısıtlıdır. Şu zamana kadar yaban domuzu ile ilgili henüz bir bildiri yokken insan izolatların dayapılan genotiplendirme çalışmalarında nadir olarak domuz suşuna (G7) rastlanmıştır. İzmir ve Manisa illerinde ameliyat materyali olarak alınan 10 insan izolatı üzerinde yapılan bir çalışmada bu izolatlara mt-CO1, atp6, nad1,rrnS sekans analizleri yapılmış ve Türkiye’de ilk kez domuz suşu (G7) saptanmıştır (18). Trakya bölgesinde 42 insan izolatında yapılan başka bir çalışmada PZR-RFLP ve PZR-SSCP metotları kullanılarak ITS-1 ve NAD1 gen bölgelerinin sekans analizi gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonucunda insan izolatlarında G1 ve G7 suşları belirlenmiştir. Bu rapor, bölgedeki ilk G7 suş bildirimidir (19).

Bu çalışmada ise nekropsisi yapılan bir yaban domuzunun akciğerinde hidatid kiste rastlanmıştır. Elde edilen izolatların mt-CO1 gen bölgelerinin DNA dizi analizleri sonucunda E. granulosus s.s. (G1 ve G3) olduğu belirlenmiştir. Dünya’daki diğer ülkelerdeki çalışmalarda olduğu gibi E. granulosus s.s. (G1 ve G3) ülkemizde de yapılan çalışmalar neticesinde baskın tür olduğu DNA sekans analizleri sonucunda gösterilmiştir. Ayrıca E. granulosus s.s.'nun (G1 ve G3) KE'nin yayılmasında en dominant tür olduğu ve yaban domuzuna da adapte olabileceği gösterilmiştir. Bu çalışma, Türkiye’de yaban domuzlarında Echinococcus türlerinin moleküler karakterizasyonunun belirlenmesine yönelik ilk çalışmadır.

Yaban hayatı son zamanlarda evcil hayvanlar ve insanlar için potansiyel bir hastalık kaynağı olmuştur. Bu durumun özellikle silvatik ve pastoral döngülerin birbirine geçmesi ile oluşabileceği akla gelmektedir. Dolayısıyla vahşi hayvanlar da evcil hayvan konaklarının dışkılarında bulunan enfektif yumurtaları alarak enfeksiyona yakalanabilirler (47). Parazit yaşam döngüsünün yanı sıra epidemiyolojik durumun önemini değerlendirmek için yaban hayatı, özellikle de evcil hayvanlarla yakın temasta bulunan endemik alanlarda daha fazla araştırma yapılmalıdır. E. granulosus’un alt türlerini veya suşlarını tanımlamak, hastalığın epidemiyolojisi ve kontrolü hakkında net bir anlayış geliştirmek için gerek yaban domuzu gerekse katırlara ait hidatid kistlerin daha fazla sayıdaki örnekle ve daha ileri düzeyde moleküler çalışmaların yapılması açısından gerekli olduğu kanaatine varılmıştır.

* Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışmada etik kurul onayına gerek yoktur.

Hasta Onayı: Makalede yer alan yaban domuzu yerel avcılar tarafından vurulup ölü olarak getirilmiş ve nekropsisi yapılmıştır. Katır ise yaşlılığa bağlı ötenazisi sonucunda nekropsisi yapılmıştır. Bu sebeple hasta onay bilgisi mevcut değildir.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulundaki kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: S.Ş., H.K.K., Dizayn: S.Ş., H.K.K., Veri Toplama veya İşleme: H.K.K., F.Ç., Ş.G.K., S.Ş., B.K., A.Ç., Analiz veya Yorumlama: H.K.K., S.Ş., F.Ç., Ş.G.K., Literatür Arama: H.K.K., F.Ç., Ş.G.K., S.Ş., Yazan: H.K.K., S.Ş., F.Ç., Ş.G.K.

Çıkar Çatışması: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemişlerdir.

Finansal Destek: Yazarlar bu çalışma için finansal destek almadıklarını beyan etmişlerdir.