GİRİŞ

Microsporidialar zorunlu hücre içi parazitlerin geniş ve genetik çeşitliliği yüksek bir grubunu oluşturmakta olup hem hayvan hem de insan patojenleri olarak bilinmektedirler (1). Bu parazitik protistalar genetik olarak mantarlarla ilişkilidir ve çevresel dirençli spor formları ile karakterize olup konak dışkısı ile çevreye yayılarak ökaryotik hücre invazyonu için yeni bir siklusu başlatırlar (2). Günümüze kadar 200 soy içerisinde yaklaşık 1400 microsporidia türü rapor edilmiş olup bunlar arasında 8 soy içerisinde 14 türün insanlarda enfeksiyona yol açtığı bildirilmiştir (3). Enterocytozoon bieneusi insanlarda ishale yol açan fırsatçı bir patojen olarak ortaya çıkmış olup immün supresyonla ilişkilendirilmiş ve rapor edilen insan microsporidiosis olgularının yaklaşık %90’ından sorumlu tür olarak karakterize edilmiştir. İnsanların yanı sıra E. bieneusi enfeksiyonları primatlar, kedi, sığır, köpek, at, domuz, kuşlar ve çeşitli yabani memelilerden tekrarlı olarak dünyanın çeşitli bölgelerinden bildirilmektedir (4). Enfekte insan ve hayvanlarla temas ve/veya kontamine gıda ve sular E. bieneusi enfeksiyonlarının bulaşmasında rol oynayan önemli faktörlerdir (1,5). Hem zoonotik hem de potansiyel konak adaptasyonu olan genotipler, birçok insan ve hayvan E. bieneusi enfeksiyonlarında sorumlu etkenler olabilirler ve hayvanlar insan enfeksiyonlarına yol açan genotipler için potansiyel rezervuardırlar (4,6).

Hayvan ve insanlardaki E. bieneusi izolatlarının genotiplendirilmesinde rRNA geninin internal transcribed spacer (ITS) bölgesinin sekans analizi genel standart yöntem olarak kullanılmaktadır (5,7). Günümüze kadar çeşitli hayvan türlerinde 240’ın üzerinde genotip identifiye edilmiştir (8,9). ITS gen bölgesi sekanslarının filogenetik analizlerine göre E. bieneusi genotiplerinin 9 farklı genogruba bölündüğü ortaya konmuştur (10). Genogrup 1 en geniş grup olup günümüze kadar rapor edilen E. bieneusi genotiplerinin %94’ünü ihtiva etmekte ve buradaki genotiplerin insanlarda da enfeksiyon oluşturmalarından dolayı zoonotik grup olarak nitelendirilmektedir (11,12). Buna karşın diğer sekiz major genogrupta (grup 2-9) yer alan genotiplerin ise çoğunlukla spesifik konaklarda ve atık sularda bulunduğu kaydedilmiştir (11,13,14). Bugüne kadar sığırlarda çoğunluğu genogrup 2’de olmak üzere 40’ın üzerinde E. bieneusi genotipi karakterize edilmiştir (15-17). Bunlar arasında 8’i genogrup 1’de 7’si de genogrup 2’de olmak üzere en az 15 genotip insanlarda da rapor edilmiş olup sığırların insan enfeksiyonları için önemli bir rezervuar olduğunun önemi vurgulanmıştır (5,8,16,18). Genotip 1, J ve BEB4’ün süt emen buzağılarda dünya çapında yaygın E. bieneusi genotipleri olduğu (15,16,18-25) ve ilgili genotiplerin en az 13 insan olgusunda tespit edildiği kaydedilmiştir (26,27).

Parazitik etkenler içerisinde oldukça önemli olan microsporidia türleri üzerine ülkemizde günümüze kadar yapılan çalışmaların sınırlı olduğu bilinmektedir. Türkiye’de insan ve hayvan konaklarda microsporidia enfeksiyonlarına yol açan türlerin genotipik çeşitliliği üzerine sınırlı sayıda araştırma yapılmıştır (28-32). Bu araştırmaların daha çok insanlarda yapıldığı buna karşın hayvanlardaki çalışmaların çok daha sınırlı olduğu görülmektedir. Evcil hayvanlar üzerinde yürütülen araştırmalarda; Düzlü ve ark. (31), Kayseri yöresinde moleküler olarak incelenen 282 köpek dışkısında Encephalitozoon intestinalis ve En. cuniculi’nin yaygınlığını sırasıyla %12,4 ve %2,1 olarak belirlemişler ve izolatların genotipik çeşitliliklerini ortaya çıkarmışlardır. Pekmezci ve ark. (32), Samsun yöresinde inceledikleri 72 ev kedisinde E. bieneusi ve En. intestinalis moleküler prevalansını sırasıyla %5,5 ve %4,1 olarak rapor etmişlerdir. Ercan (33), Kayseri, Kırşehir ve Nevşehir yörelerinde 300 tavuktan alınan dışkı örneklerinde E. bieneusi ve Microsporidia sp. pozitifliğini moleküler olarak sırasıyla %7,3 ile %0,7 olarak belirlemiş ve elde edilen izolatların genotiplendirmesini yapmıştır.

Günümüze kadar Türkiye’de sığırlarda E. bieneusi’nin varlığı ve moleküler karakterizasyonu üzerine herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, sağlıklı görünümlü farklı yaş, cinsiyet ve ırklardaki sığırlarda E. bieneusi’nin moleküler olarak araştırılması ve enfeksiyona yol açan genotiplerin ortaya konarak filogenetik yapılanmalarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma sonucu elde edilen çıktılar Türkiye’deki sığırlarda microsporidia enfeksiyonları üzerine ilk moleküler verileri sağlamış olup E. bieneusi’nin araştırma yöresinde oluşturduğu zoonotik risk potansiyeli üzerine de bilimsel veriler sağlamıştır.

YÖNTEMLER

Dışkı Örneklerinin Toplanması ve Genomik DNA İzolasyonu

Çalışma, Ekim 2017 ve Mart 2018 tarihleri arasında halk elinde yetiştiriciliği yapılan farklı yaş, cinsiyet ve ırklardan sığırlar üzerinde yürütülmüştür. Çalışma materyalini oluşturan dışkı örnekleri hayvanların dışkılamasını takiben yere temas etmeyen kısmından alınmış olup hayvanlara temas olmaması sebebiyle Erciyes Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun 29.01.2016 tarih ve 04 sayılı Yönergesi kapsamında etik kurul onayına gerek duyulmamıştır. Çalışma süresince toplam 150 sığırdan dışkı örnekleri toplanmış ve steril dışkı kaplarına alınarak soğuk zincir altında laboratuvara intikal ettirilmiştir. Her örneğe protokol numarası verilerek hayvanlara ait bilgiler ile birlikte kayıt altına alınmıştır. Dışkı örneklerinden gDNA izolasyonları, QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Almanya) kullanılarak kit prosedürüne göre gerçekleştirilmiştir. Elde edilen gDNA ekstraktlarından alınan örnekler Qubit® Fluorometric Quantitation (Life Technologies) cihazında işlenerek total gDNA miktarları (ng/µL) belirlenmiş ve kullanılana kadar -20 °C’de muhafaza edilmiştir.

Ribozomal ITS Gen Bölgesinin Amplifikasyonu

Dışkı örneklerinden elde edilen gDNA izolatları E. bieneusi DNA’sının varlığı yönünden ribozomal ITS gen bölgesinin yaklaşık 390 bp kısmını spesifik olarak amplifiye eden primerlerle nested polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) analizlerine tabi tutulmuştur (34). Elde edilen PZR ürünlerinin her birinden 10 µL alınıp %1,5’luk agaroz jelde elektroforeze tabii tutulduktan sonra sonuçlar Gene Snap from Syngene analiz programı (UVP INC Uplant, CA) ile görüntülenip analiz edilmiştir.

Sekans ve Genotiplendirme Analizleri

E. bieneusi pozitif izolatların PZR analizleri sonrası ribozomal ITS amplikonları sekans analizleri için jel pürifiye (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche) edilmiştir. Sekans analizleri ikinci PZR analizlerinde kullanılan gen spesifik forward ve reverse primer dizileri ile çift yönlü olarak gerçekleştirilmiştir (Macrogen Europe). Çift yönlü DNA dizisi belirlenen izolatlara ait kromotogramlar Geneious 11.0.2 (35) yazılımında De Novo Assamble ile işlenmiş ve kalite skoru yüksek olan final konsensus dizilimler belirlenmiştir. Bu dizilimden PZR primerleri çıkarılarak hedef bölge sekansları (350 bp) elde edilmiştir. Elde edilen sekansların Geneious 11.0.2 yazılımı (35) üzerinden BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) algoritması kullanılarak GenBank’ta mevcut homolog izolatlara ait ilgili gen bölgesi sekanslarıyla çoklu hizalamaları yapılmış, moleküler karakterizasyonları sağlanmış ve akabinde GenBank kayıtları gerçekleştirilmiştir. İlgili sekanslar içinden 243 bp uzunluğundaki E. bieneusi complete ITS sekansları alınarak, BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi) algoritması ile GenBank’ta kayıtlı tüm E. bieneusi genotiplerine ait nükleotid sekansları ile hizalama analizleri gerçekleştirilmiş ve elde edilen sonuçlarla izolatların genotiplendirmeleri yapılmıştır.

Filogenetik Analizler

Genogrup ve genotipler arasındaki genetik farklılıklar Kimura two-parameter uzaklık modeli (36-38) kullanılarak MEGA 7 yazılımında (38) gerçekleştirilmiştir. E. bieneusi genotiplerine ait nesillerin, filogenetik yapılanmalarının belirlenmesinde GenBank veri tabanında kayıtlı çeşitli genogruplara ait izolatların ITS gen bölgesi dizilimleri ile data seti oluşturulmuştur. Filogenetik ağaçların oluşturulmasında Maximum Likelihood (ML) analizleri uygulanmıştır. ML analizlerinde sekans evrimi için en uygun substitution modelinin belirlenmesinde jModelTest v.0.1.1 (39) kullanılmış ve en düşük AIC (Akaike Information, Criterion, correction) değerine sahip model filogenetik ağacın oluşturulmasında kullanılmıştır. ML analizleri Geneious 11.0.2 (35) yazılımı üzerinden PhyML (40) plugin kullanılarak gerçekleştirilmiştir. ML analizleriyle oluşturulan ağaçların güvenilirliğinin tespit edilmesinde 1000 tekrarlı Bootstrap testi kullanılmıştır.

İstatistiksel Analiz

İstatiksel analizler, IBM SPSS Statistics 20.0 yazılımında gerçekleştirilmiştir. İncelenen sığırlarda E. bieneusi moleküler prevalansı ile yaş ve ırk faktörlerinin ilişkisi Pearson’s chi-square, cinsiyet faktörünün ilişkisi de Fisher’s exact testi ile araştırılmıştır.

BULGULAR

E. bieneusi’nin Moleküler Prevalansı ve Risk Faktörlerinin Analizi

Farklı yaş grupları, cinsiyet ve ırklardan olan 150 sığıra ait dışkı örneklerinden elde edilen gDNA izolatlarının 29’u (%19,3) ITS bölgesini amplifiye eden tür spesifik primerlerle PZR analizleri sonucu E. bieneusi DNA’sı yönünden pozitif belirlenmiştir. Nested PZR analizleri ile pozitif belirlenen bazı izolatların agaroz jel üzerinde görünümleri Şekil 1’de verilmiştir.

E. bieneusi pozitifliği belirlenen sığırların yaş, cinsiyet ve ırk gruplarına göre dağılımları ve istatistiksel analizleri Tablo 1’de verilmiştir. Yaş gruplarına göre E. bieneusi pozitifliği en yüksek %18,0 ile >3 yaş grubunda belirlenmiş bunu %0,7 oranlar ile ≤1 yaş ve 1-3 yaş grupları izlemiştir. Yaş gruplarına göre E. bieneusi pozitifliğinin dağılımında istatistiksel açıdan >3 yaş grubu ile ≤1 yaş ve 1-3 yaş grupları arasındaki farklılık önemli (p<0,05) bulunurken ≤1 yaş ve 1-3 yaş grupları arasındaki farklılık önemsiz (p>0,05) bulunmuştur. Sığırların cinsiyetine göre erkeklerde %2,7 dişilerde ise %16,7 oranında E. bieneusi pozitifliği tespit edilmiştir. Irka göre E. bieneusi pozitifliği en yüksek %6,0 ile Holstein ve Montofon ırklarında belirlenmiş, bunu %4,7 ile Simental ve %2,7 ile Melez ırkları izlemiştir. Yerli ırklarda E. bieneusi enfeksiyonu saptanmamıştır. Cinsiyet ve ırka göre E. bieneusi pozitifliğinin dağılımında istatistiksel açıdan önemli bir farklılık bulunmamıştır (p>0,05).

Ribozomal ITS Gen Bölgesi Sekans ve Genotiplendirme Analizi Sonuçları

Nested PZR analizleri ile pozitif belirlenen 29 izolatın tamamı sekans analizlerine tabii tutulmuş ve tüm izolatlar için kalite soru yüksek (q>20) final sekanslar elde edilmiştir. Çalışmada belirlenen E. bieneusi izolatlarının genotiplendirmede referans olan 243 bp uzunluğundaki ITS sekansları arasında 221 (%90,8) identik bölge belirlenirken 5 farklı genotipi ortaya koyan 22 polimorfik bölge saptanmıştır. E. bieneusi pozitif 29 izolatın genotiplere göre dağılımları GenBank aksesyon numaraları ile birlikte Tablo 2’de verilmiştir. Belirlenen genotipler arasında intraspesifik nükleotid farklılığı ortalama %2,8±0,6 olarak saptanmıştır. Çalışmada karakterize edilen ve en yaygın bulunan ERUSS1 genotipi ile birer sığırda belirlenen ERUSS2, ERUSS3 ve ERUSS4 genotiplerine ait izolatların nükleotid sekansları arasında %0,3-%0,6 farklılık belirlenmiştir. ERUSS2 ile ERUSS3 ve ERUSS4 genotiplerine ait izolatların nükleotid sekansları arasında %0,6-%0,9, ERUSS3 ile ERUSS4 genotiplerine ait izolatların nükleotid sekansları arasında ise %0,9 farklılık saptanmıştır. Yukarıdaki genotiplerden genetik olarak daha uzak belirlenen ve iki sığırdan izole edilen N genotipine ait izolatlar ERUSS1, ERUSS2 ve ERUSS3 genotiplerine %5,9, ERUSS4 genotipine ise %6,2 farklılık göstermiştir.

Filogenetik Analiz Sonuçları

Moleküler olarak karakterize edilen E. bieneusi genotiplerinin Dünyada çeşitli bölgelerdeki farklı konaklardan bildirilen çeşitli genotiplere ait izolatlarla ilişkileri filogenetik ağaç üzerinde (Şekil 2) gösterilmiştir. ML filogenisine göre oluşturulan filogenetik çözünürlük genogruplar bazında yüksek bootstrap oranları ile desteklenmiştir. Çalışmada karakterize edilen genotiplere ait izolatların tamamının E. bieneusi genogrup 2’de yer aldığı belirlenmiştir. Birbirine yakın olarak belirlenen ve ilk kez bu çalışma ile karakterize edilen ERUSS1-4 genotiplerine ait izolatların Çin, İsveç ve ABD’de sığır, koyun, çeşitli geyik türleri, kedi, çinçilla ve çeşitli maymun türlerinden rapor edilen, konak spekturumu geniş olan BEB6 genotipi (%99,2-%99,6) ve Çin’de bir insandan izole edilen SH5 genotipi (%99,2-%99,6) ile genetik olarak yakın oldukları ve birlikte kümelendikleri tespit edilmiştir (Şekil 2). Çalışmada iki sığırdan izole edilen ve araştırma sahasında belirlenen diğer genotiplerden daha uzak belirlenen N genotipine ait izolatların Almanya’da bir sığırdan izole edilen aynı genotipe ait izolatla %100,0 identik olduğu ve ayrı bir küme oluşturduğu belirlenmiştir (Şekil 2). N genotipine ait bu izolatların en yüksek genetik yakınlığı %99,6 ile Çin ve Almanya’da sığırlardan izole edilen J genotipine ait izolatlarla gösterdikleri, yine ilgili izolatların aynı ülkelerden rapor edilen 1 genotipine de %99,2 benzer oldukları belirlenmiştir.

TARTIŞMA

Bu çalışma ile Türkiye’de ilk kez sığırlarda microsporidia türlerinden E. bieneusi’nin varlığı ve yaygınlığı moleküler olarak ortaya konmuştur. Araştırma yöresinde incelenen sığırlarda E. bieneusi moleküler prevalansı %19,3 olarak saptanmış olup elde edilen sonuçlar sekans analizleriyle de konfirme edilmiştir. Saptanan bu moleküler prevalans oranının Çin’in farklı bölgelerinde sütçü sığır ve buzağılarda bildirilen (8,19-22) prevalans oranları (%17,7-%29,3) ile yakın olduğu görülmüştür. Ayrıca ABD, Brezilya, Arjantin ve Çek Cumhuriyeti’nde yine sütçü sığırlardan %3,1 ile %35,4 arasında değişen E. bieneusi yaygınlığı rapor edilmiştir (16,23-25,41,42). Çeşitli ülkelerden bildirilen E. bieneusi prevalansındaki farklılıklarda, Qi ve ark.’nın (21) da belirttiği gibi farklı teşhis yöntemlerinin uygulanması, çalışma dizaynı, örneklenen hayvanların coğrafik bölgeleri ve yaşları, çiftlik yönetimi ve mevsimsel varyasyonlar gibi çeşitli faktörlerin önemli olduğu düşünülmüştür.

Çeşitli araştırmalarda (21,24) sığırlarda E. bieneusi prevalansında yaşla ilişkili bir azalış olduğu ve bunun da muhtemelen yaşın artması ile gelişen immünite ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Jurankova ve ark. (24) Çek Cumhuriyeti’nde E. bieneusi prevalansını en yüksek %26,7 ile <3 ay yaş grubu sığırlarda belirlemişler, bunu %18,3, %6,7, ve %10,0 ile 6-8 ay, 14-16 ay ve 28-30 ay yaş gruplarının izlediğini rapor etmişlerdir. Benzer olarak Çin’de yapılan araştırmalarda (19,20) süt emen ve sütten kesilmiş buzağılarda düve ve ergin sütçü sığırlara oranla daha yüksek E. bieneusi prevalansı bildirilmiştir. Buna karşın ABD ve Brezilya’da sütçü sığırlar üzerinde yürütülen çalışmalarda (25,41) sütten kesilmiş buzağılarda süt emen buzağılara oranla daha yüksek enfeksiyon oranları rapor edilmiştir. Çalışmamızda ise yaş gruplarına göre E. bieneusi pozitifliği en yüksek %18,0 ile >3 yaş grubu sığırlarda belirlenirken, ≤1 yaş ve 1-3 yaş gruplarındaki prevalans oranları %0,7 olarak tespit edilmiş ve bu farklılık istatistiksel olarak da önemli bulunmuştur. Bu farklılığın yaş grupları arasında incelenen hayvan sayısı dağılımları ile ilişkili olduğu düşünülmüş olsa da elde edilen sonuçlar özellikle ergin sığırların E. bieneusi enfeksiyonlarının bulaşması için potansiyel rezervuar olduklarını ortaya çıkarmıştır.

Çalışmamızda dişi ve erkek sığırlar arasında E. bieneusi enfeksiyonlarının dağılımında bir farklılık belirlenmemiştir. Cinsiyetin E. bieneusi enfeksiyonu üzerine etkisinin bulunmadığı ayrıca sığırlar (43) ve atlar (44) üzerinde yapılan araştırmalarda da kaydedilmiştir. Buna karşın köpek, kedi ve yabani memeliler üzerinde yürütülen bazı araştırmalarda (45-47) ise erkeklerde dişilere oranla daha yüksek enfeksiyon oranları rapor edilmiştir. Sığır ırkları arasında enfeksiyon oranlarının sütçü sığır ırklarında besi sığırlarına oranla daha yüksek olduğu bazı çalışmalarla (20,43) rapor edilirken, Santin ve ark. (48), 6-18 aylık besi sığırlarında enfeksiyon oranlarını daha yüksek belirlemişlerdir. Çalışmamızda ırka göre E. bieneusi pozitifliği en yüksek %6,0 ile Holstein ve Montofon ırkında saptanmış olup bunu %4,7 ile Simental ve %2,7 ile Melez ırkları izlemiştir. Yerli ırklarda ise E. bieneusi enfeksiyonu saptanmamıştır. Yapılan istatistiksel analizde sığır ırkları arasında enfeksiyonun prevalansı açısından bir farklılık olmadığı tespit edilmiştir.

Çalışmamızda sağlıklı sığırlarda moleküler olarak identifiye edilen 29 E. bieneusi izolatının ITS rRNA sekans analizleri ile 5 ayrı genotipe ait oldukları ve tüm genotiplerin genogrup 2’de yer aldığı belirlenmiştir. Bunlar arasında ERUSS1 en yaygın genotip olarak belirlenmiş olup daha sınırlı olduğu görülen diğer genotipler ERUSS2-4 ile genetik olarak çok yakın olduğu dikkati çekmiştir. İlgili genotipler dünyada ilk kez karakterize edilmiş olup, Çin (49,50-53), İsveç (54) ve ABD’de (55) sığır, koyun, çeşitli geyik türleri, kedi, çinçilla ve çeşitli maymun türlerinden rapor edilen ve konak spekturumu geniş olan BEB6 genotipi (%99,2-%99,6) ve Çin’de bir insandan izole (56) edilen SH5 genotipi (%99,2-%99,6) ile genetik olarak çok yakın oldukları görülmüştür. Bu sonuç ilgili genotiplerin sığırlar dışında diğer hayvan türlerinde de bulunabileceğini ve zoonotik risk potansiyeline sahip olabileceklerini düşündürmüş olmakla birlikte araştırma yöresinde diğer hayvan türleri ve insanlar üzerinde yapılacak kapsamlı araştırmalarla ilgili genotiplerin moleküler epidemiyolojisi ve zoonotik risk potansiyellerinin aydınlatılmasına ihtiyaç bulunmaktadır. Araştırmamızda iki sığırda bulunan izolatların N genotipine ait olduğu ve yörede saptanan diğer genotiplerden daha farklı olduğu görülmüştür. İlgili genotipin günümüze kadar yalnızca Almanya’da bir sığırdan bildirildiği (GenBank aksesyon: AF267144) görülmektedir. Elde edilen bu sonuç yalnızca sığırlardan rapor edilen ilgili genotipin konak spesifik karakterli olabileceğini desteklemektedir.

SONUÇ

Bu çalışma ile sığırlarda önemli zoonotik microsporidialardan biri olan E. bieneusi’nin varlığı ve yaygınlığı ortaya konmuştur. Elde edilen sonuçlar Türkiye’de sığırlarda ilgili parazit üzerine ilk moleküler verileri sağlamıştır. Ayrıca çalışmada saptanan ERUSS1-4 genotipleri dünyada ilk kez bildirilmiş ve moleküler klasifikasyona kazandırılmıştır. Tespit edilen genotiplerin, zoonotik karakterli diğer bazı genotiplerle birlikte aynı grupta yer alması ve genetik olarak yakın olmaları bu genotiplere ait E. bieneusi nesillerinin insanlara bulaşma açısından risk potansiyeli taşıdığını da ortaya çıkarmıştır.

TEŞEKKÜR

Bu çalışma Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TYL-2017-7384 nolu proje ile desteklenmiştir.

* Etik

Etik Kurul Onayı: Dışkı materyali hayvanların dışkılamalarını takiben hayvana temas edilmeden yerden alınmış olması nedeniyle etik kurul onayı alınmamıştır.

Hasta Onamı: Sığır dışkı örneklerinde çalışılması nedeniyle hasta onayı alınmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: T.B., A.Y., Dizayn: T.B., A.Y., Veri Toplama veya İşleme: T.B., S.U., G.K.K., M.O., G.Y., Analiz veya Yorumlama: T.B., A.Y., S.U., Literatür Arama: T.B., S.U., G.K.K., M.O., G.Y., Yazan: T.B., A.Y., M.O., S.U.

Çıkar Çatışması: Yazarlar arasında bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Finansal Destek: Çalışma Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TYL-2017-7384 nolu proje ile desteklenmiştir.