GİRİŞ

Intestinal yerleşimli protozoonlar arasında yer alan Dientamoeba fragilis (D. fragilis), 5-15 µm boyutlarında olup dışkı örneklerinde sıklıkla trofozoit formunda saptanmaktadır. Dünya çapında kozmopolit bir dağılım göstermektedir (1). Parazit 1918 yılında apatojen bir amip türü olarak tanımlanmıştır. Ancak, yıllar içerisinde yapılan detaylı morfolojik ve genetik çalışmalar sonucu parazitin evrimsel olarak kamçılı trikomonadlar grubunda yer aldığı ortaya konulmuştur. Enfeksiyon olguların çoğunda asemptomatik olarak geçirilmekte, semptomatiklerde ise iştah kaybı, ishal, konstipasyon ve bulantı-kusma gibi non-spesifik gastrointestinal bulgular görülebilmektedir (2).

Tanımlanmasının üzerinden yüzyıldan fazla zaman geçmiş olmasına karşın D. fragilis’in kist formunun varlığı kesin olarak saptanamamıştır. Yapılan güncel çalışmalarda parazitin kist formunun da bulunduğu ancak dışkı örneklerinde sıklıkla trofozoit formunun görüldüğü belirtilmektedir. Trofozoit formunun ise dış ortam koşullarına son derece dayanıksız olduğu göz önüne alındığında fekal-oral bulaşta rolünün olmadığı öngörülmektedir. Dientamoeba fragilis’in bulaşının Enterobius vermicularis (E. vermicularis) yumurtaları ile taşınan trofozoitler aracılığıyla olduğu hipotezi, halen araştırmacılar tarafından kabul gören en yaygın görüştür (3).

D. fragilis’in kesin tanısı, karakteristik nükleer yapının boyanmamış dışkı örneklerinde görülememesi nedeniyle kalıcı boyama yöntemlerini gerektirmektedir. Parazitin dış ortama oldukça dayanıksız yapısı, değişken bir morfolojiye sahip oluşu, deneyimli laboratuvar çalışanına gereksinim duyulması parazitin kalıcı boyalı preparatlarla da sıklıkla tanısının atlanmasına neden olmaktadır ve son yıllarda moleküler yöntemlerin bu parazitin tanısındaki popülaritesi artmıştır (2). D. fragilis varlığının saptandığı olgular tüm kıtalarda birçok ülkeden bildirilmiş olmakla beraber gelişmiş ülkelerden bildirilen çalışmalar gelişmekte olanlara oranla daha fazla olduğu dikkati çekmektedir (4,5). Parazitin görülme sıklığının bildirildiği çok sayıda çalışma literatürde yer almaktadır. Ancak, bu çalışmalarda kullanılan yöntemlerin farklı olması nedeniyle oranlar büyük farklılık gösterebilmektedir (%0,2-82). Ayrıca, diğer bağırsak parazitlerinin aksine gelişmiş ülkelerde daha yüksek görülme sıklıkları rapor edilmiş olsa da bu farklılıkların güvenilirliği sınırlıdır, çünkü tanı yöntemlerinin duyarlılık ve özgüllükleri büyük oranda değişiklik göstermektedir. Ayrıca çalışmaların tasarlanış şekilleri arasındaki farklılıklar da bildirilen oranlardaki büyük farklıların nedeni olabilir. Bunun yanı sıra, moleküler yöntemlerin kullanıldığı prevelans çalışmaları göz önüne alındığında; Avrupa, Amerika ve Orta Doğu ülkelerinde parazitin görülme sıklığının oldukça yüksek (>%20) olduğu rapor edilmiştir (5-7). Bu çalışmada öncelikle D. fragilis ile E. vermicularis birlikteliğinin araştırılması ve saptanan izolatların genotiplendirilmesi amaçlanmıştır. Ayrıca, D. fragilis olgularının demografik özelliklerinin ve klinik bulgularının değerlendirilmesi çalışmanın bir diğer amacını oluşturmaktadır.

YÖNTEMLER

Örnekler

Ekim 2017-Ekim 2018 arasında Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Parazitoloji Laboratuvarı’na gönderilen 391 olguya ait rutin selofanlı lam ve dışkı örnekleri çalışmamız kapsamında değerlendirilmiştir. Selofanlı lam örneklerinde E. vermicularis yumurtaları saptanan ardışık 74 olgunun dışkı örneği ile aynı tarih aralığında E. vermicularis saptanmayan 74 olguya ait dışkı örneği basit rastgele örnekleme metodu ile araştırmaya alınmıştır. Olgulara ulaşılarak bilgilendirilmiş gönüllü olur formu imzalatılmış ve gönüllüler çalışmaya alınmıştır. Gönüllü olan olgulara cinsiyet, yaş, semptomlar ve yaşanılan yer bilgilerini kapsayan anket uygulanmıştır.

Direkt Mikroskopi, Boyama ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)

Çalışma kapsamına alınan 148 dışkı örneğinin tamamı trikrom boyama yöntemi ile boyanmış ve hazırlanan boyalı preparatlar 100X büyütme ile mikroskop altında D. fragilis açısından incelenmiştir. Ayrıca tüm dışkı örneklerinden DNA izolasyonu yapılmış ve PZR yöntemi ile D. fragilis DNA’sının varlığı açısından incelenmiştir. QIAamp Fast DNA stool mini kit kullanılarak yapılan genomik DNA izolasyonu aşamasında kit prosedürü üretici firmanın bildirildiği şekilde uygulanmıştır. PZR yöntemi için DF400 (ileri 5-TATCGGAGGTGGTAATGACC-3) ve DF1250 (geri 5’-CATCTTCCTCCTGCTTAGACG-3’) primerleri kullanılmıştır. Reaksiyon koşulları: ön denatürasyon 94 °C üç dk, 30 döngü (denatürasyon: bir dk 94 °C, annealing: 57 °C’de 1,5 dk ve elongasyon 72 °C’de iki dk), final uzama ise 72 °C’de 10 dk olarak uygulanmıştır.

Sekans Analizi ve Genotiplerin Belirlenmesi

Saptanan D. fragilis'ler alt tiplerinin belirlenmesi amacıyla ticari bir firmaya sekanslanması amacıyla gönderilmiştir. Basic local alignment search tool (BLAST) kullanılarak D. fragilis 18S rRNA sekansları Genbank’da yer alan mevcut sekanslar ile karşılaştırılmıştır. Analiz sonucunda sekansların tam veya en yüksek benzerliğe sahip oldukları alt tipler belirlenmiş ve evrim ağacı oluşturulmuştur. İzolatlar arasındaki genetik uzaklık ilişkisi 18S rRNA gen sekansları temel alınarak belirlenmiştir.

İstatistiksel Analiz

Anket verileri SPSS for Windows 15.0 kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Parazitlerin birlikteliğini ve tanı yöntemlerini karşılaştırmak ayrıca demografik özellikler ve klinik bulgular ile parazit varlığı arasındaki ilişkiyi incelemek amacıyla ki-kare testi uygulanmıştır.

BULGULAR

Çalışmaya 67’si kadın (%45,28), 81’i erkek (%54,72) toplam 148 gönüllü dahil edilmiş olup olguların yaş aralığı 1 ile 85 arasında (ortalama: 23,87±11,89) değişmektedir. Trikrom boyama yöntemi ile E. vermicularis pozitif 74 olgunun üçünde (%4), PZR ile ise 28 olguda (%37,8) D. fragilis pozitifliği belirlenmiştir. Trikrom boyama yöntemi ile kontrol grubundaki 74 olgunun birinde (%1,3), PZR ile 14’ünde (%18,9) D. fragilis pozitifliği görülmüştür (Tablo 1). İstatistiksel olarak D. fragilis ile E. vermicularis’in birlikteliğinin (Tablo 2) anlamlı olduğu saptanmıştır (p<0,05).

Genotiplendirme için basit rastgele örneklem metoduyla 26 izolat seçilerek bunların sekans analizi yapılmıştır. Sekanslanan tüm D. fragilis izolatları genotip 1 olarak saptanmıştır. Dizileme için gönderilen 26 örnek analiz edildiğinde 24 izolatın sekanslarının tamamen aynı olduğu belirlenmiştir ve bu dizi Genbank’a (referans no: AduDf14, erişim kodu: MN560149) kaydedilmiştir. Bunların dışındaki iki sekansın da birbiriyle aynı olduğu saptanmış olup Genbank’a ayrı bir dizi olarak kaydedilmiştir (referans no: AduDf138, erişim kodu: MN560150). Çalışmamızda elde ettiğimiz AduDf14 ile genotip 1 arasında bir baz farklılık bulunmakta olup BLAST analizine göre iki sekans arasında %99,75 benzerlik saptanmıştır. AduDf138 olarak adlandırıldığımız diğer izolat genotip 1 ile karşılaştırıldığında ise %99,63 benzerlik ve iki baz farklılığı bulunmuştur. Çalışmamızdaki diziler genotip 2 ile karşılaştırıldığında benzerlik oranları AduDf14 için %95,01 ve AduDf138 için %94,89 olarak saptanmıştır. Sekanslanan tüm D. fragilis izolatları ve referans diziler filogenetik analiz için birlikte değerlendirilerek evrim ağacı oluşturulmuştur (Şekil 1). Elde edilen veriler ışığında sekanslanan 26 izolatın da genotip 1’e ait olduğu saptanmıştır.

Olguların yaşadıkları yer ve cinsiyetleri ile parazit varlığı arasında anlamlılık saptanamamıştır (Tablo 3). D. fragilis pozitifliği ile olguların semptomları arasında anlamlı bir ilişki görülmemiştir (Tablo 4).

TARTIŞMA

İlk defa Jepps ve Dobell tarafından 20. yy başlarında klinik önemi olmayan bir amip olarak tanımlanan D. fragilis’in günümüzde insan kolonunda yerleşen kamçılı bir protozoon olduğu bilinmektedir. Morfolojik olarak amip benzeri bir yapıda ve 5-15 µm boyutlarında olan parazit, dışkı incelemelerinde çoğunlukla çift çekirdekli trofozoit formu ile görülmektedir. Parazitin tanımlanmasından itibaren geçen bir asırlık süre boyunca yapılan ileri genetik, immünolojik ve morfolojik incelemeler sonucunda D. fragilis’in filogenetik olarak trikomonad kamçılılar ile ilişkili olduğu anlaşılmıştır (1,8). Son yıllarda yapılan kısıtlı sayıdaki çalışmada parazitin kist formunun saptandığı rapor edilmiş olsa da bu formun varlığı halen kesinlik kazanmamıştır. Kist formunun olabileceği görüşü bulaş yolu hakkında yeni fikirlerin ortaya çıkmasına neden olsa da parazitin E. vermicularis yumurtalarıyla fekal-oral olarak kişiden kişiye bulaştığı hipotezi araştırmacılar tarafından kabul edilen en yaygın görüş olarak varlığını sürdürmektedir. Dış ortam şartlarında canlılığını kısa sürede kaybeden D. fragilis trofozoitlerinin bir nematod olan E. vermicularis yumurtaları içerisinde korunarak mide asidinden geçtiği ve bağırsaklara ulaştığı yaygın olarak kabul edilmektedir (8). Cerva ve ark. (9) iki parazitin birlikteliğini araştırdıkları çalışmalarında 414 apendiks örneğini incelemişlerdir. İncelenen apendiks kesitlerinde D. fragilis %4,8, E. vermicularis ise %8,7 oranında pozitif bulunmuştur. Ayrıca iki parazitin birlikteliği istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Nematod yumurtalarının D. fragilis bulaşındaki rolünü araştıran Ockert, saflaştırdığı E. vermicularis yumurtalarını oral yoldan alarak D. fragilis ile kendisini enfekte etmiştir (10). Tanı yöntemi olarak PZR’nin seçildiği 2012-2017 tarihleri arasında Avusturya’da gerçekleştirilen araştırmada D. fragilis pozitif 163 olgunun retrospektif incelemesinde olguların %23,3’ünün eş zamanlı olarak E. vermicularis ile de enfekte olduğu görülmüştür (11). Ülkemizde iki parazitin birlikteliğinin incelemek amacıyla üç gün ard arda dışkı ve selofan bant örneği alınan olgularda, D. fragilis ve E. vermicularis birlikteliğinin istatistiksel olarak anlamlı olduğu (p<0,05) bildirilmiştir (12). Yaptığımız çalışmada E. vermicularis negatif olgulardan oluşan kontrol grubundaki 74 olgunun 14’ü (%18,91) ve çalışma grubundaki E. vermicularis ile enfekte 74 olgunun 28’i (%37,83) D. fragilis varlığı açısından pozitif bulunmuştur. Kontrol grubundaki (E. vermicularis negatif) olgularda D. fragilis saptanma oranı E. vermicularis pozitif olguların yarısı kadar olup saptanan değer istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) çıkmıştır. Aynı parazitlerin birlikteliğinin incelendiği diğer çalışmalar ile bulgularımız benzerlik göstermektedir.

Farklı ülkelerde yapılan genotiplendirme çalışmalarında saptanan D. fragilis izolatlarının sıklıkla genotip 1’e ait olduğu göze çarpmaktadır. Geniş kapsamlı bir genotiplendirme çalışmasında D. fragilis ile enfekte olguların dışkı örneğinden parazit DNA’sı elde edilmiş ve SSU rRNA analiziyle D. fragilis genotipleri belirlenmiştir. Çalışmaya 30’u Avustralya, 19’u Brezilya, 37’si İtalya ve 25’i Danimarka’da ikamet eden toplam 111 olgunun dışkı örneği dahil edilmiş ve bunların 110’ununda saptanan D. fragilis’lerin genotip 1’e ait olduğu belirlenmiştir (13). Asemptomatik 126 olgunun incelendiği 2015 tarihli Brezilya merkezli araştırmada 19 örnekte D. fragilis DNA’sı saptanmış ve yapılan sekans analizinde tüm izolatların genotip 1’e ait olduğu belirlenmiştir (14). Genotiplendirme konusunda yapılan birçok çalışmaya benzer şekilde bizim araştırmamızda da sekans analizi yaptığımız tüm D. fragilis izolatları genotip 1 olarak belirlenmiştir. Yapılan çalışmalarda genotip 2’nin daha nadir saptanması sebebiyle bu alt tipi yakalayabilmek amacıyla örneklem büyüklüğünün yapılacak ileri tarihli çalışmalarda genişletilmesi gerektiği düşünülmüştür.

Hollanda’da gastrointestinal sistem yakınmaları olan 132 olgu ile sağlıklı 77 olgu dışkısında real-time PZR ile D. fragilis varlığı araştırılmış, sağlıklı olgularda semptomatiklere kıyasla parazitin daha yüksek oranda saptandığı bildirilmiştir (sırasıyla: %50,6 ve %43,2). Çalışmada ayrıca klinik bulgular ile parazit varlığı arasında anlamlı bir ilişkinin olmadığı vurgulanmıştır (16). Benzer şekilde çalışmamızda da D. fragilis pozitifliği ile semptomlar arasında anlamlı bir ilişki saptanamamıştır (p>0,05). Bulgularımız bu konuda yapılan diğer çalışmalarla benzerlik gösterse de çalışmamızdaki olguların tıp fakültesi hastanesine değişik yakınmalarından dolayı başvuran hastalardan oluşması ve D. fragilis varlığından bağımsız olarak olguların tümünün en az bir klinik bulgu göstermesi, D. fragilis pozitifliği ile klinik bulgular arasında anlamlı bir ilişki saptanamamasının sebebi olabileceği düşünülmüştür.

Ülkemizde boyama yöntemleri ile D. fragilis varlığının araştırıldığı çalışmalarda parazitin prevalansı %0,2 ile %9 oranlarında değişen oranlarda rapor edilmiştir (17,18). Örneklem seçiminde araştırmamıza benzerlik gösteren bir çalışmada Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Parazitoloji Laboratuvarı’na gönderilen 400 dışkı örneğinin %8,8’inde D. fragilis saptandığı bildirilmiştir (19). Yaptığımız bu çalışmada trikrom boyama metoduyla D. fragilis varlığını araştırdığımız 148 dışkının %2,7’sinde parazit trofozoitleri görülmüş olup bu konuda ülkemizde yayınlanan diğer veriler ile bulduğumuz oran benzerlik göstermektedir. Ancak D. fragilis varlığının araştırıldığı yöntem olarak PZR baz alındığında bildirilen oranlar yükselmektedir. Kurt ve ark. (20) 156 sağlıklı olgudan aldıkları dışkı örneğini PZR ile D. fragilis DNA’sının varlığı açısından incelemiş ve gönüllülerin %26,9’unda parazit DNA’sının saptandığını bildirmişlerdir. Olguların sağlıklı gönüllülerden oluşmasına rağmen saptanan yüksek pozitiflik oranı dikkati çekmiştir (20). İzmir’de moleküler yöntemlerin kullanıldığı bir diğer araştırmada 292 olgu dışkısında PZR metodu ile D. fragilis DNA’sı araştırılmış ve örneklerinin %18,2’sinde beklenen boyutta bant saptanmıştır (21). Çalışmamıza dahil edilen örneklerde D. fragilis varlığı PZR ile araştırıldığında örneklerin %28,37’sinde D. fragilis DNA’sının olduğu görülmüştür. Bulduğumuz oranın yapılan diğer çalışmalara oranla görece fazla çıkmasının nedeni olarak, çalışılan örneklerinin yarısının E. vermicularis pozitif olgulardan elde edilmesinden kaynaklı olabileceği düşünülmüştür. Sadece E. vermicularis negatif olgular baz alındığında 74 olgunun %18,9’unda PZR ile D. fragilis varlığı saptanmış olup bu oran İzmir’de 2010 yılında gerçekleştirilen çalışma ile yakın benzerlik göstermektedir. Tanıda farklı metotların birlikte uygulandığı çalışmalarda, kullanılan tanı yöntemine göre saptanan D. fragilis oranlarının bariz olarak değiştiği dikkat çekmektedir. Real-time PZR, geleneksel PZR ve trikrom boyama yöntemlerinin karşılaştırıldığı araştırmada Sivcan ve ark. (22) 121 olgunun dışkı örneğini D. fragilis varlığı açısından incelemiştir. Parazitin varlığını saptamada, real-time PZR ile 13 (%10,7), PZR ile 7 (%5,7) ve trikrom boyama ile iki (%1,7) olgunun dışkısında D. fragilis saptandığı bildirilmiştir (22).

SONUÇ

Laboratuvar tanısında sıklıkla boyama ve kültür yöntemleri kullanılan D. fragilis’in nativ-lugol gibi direkt mikroskobik yöntemler altında tespit edilmesi oldukça güçtür. Moleküler tekniklerin gelişmesi, kolay ulaşılabilir ve uygulanabilir olmasıyla birlikte D. fragilis tanısında bu tekniklerin kullanımı yaygınlaşmaktadır. Çalışmamızda D. fragilis’in sıklıkla E. vermicularis pozitif olgulara eşlik edebileceği görülmüş ve bu olgularda D. fragilis varlığının araştırılması gerektiği vurgulanmıştır. Ayrıca rutin uygulamada tanısı sıklıkla atlanabilen bir protozoon olan D. fragilis’in tanısında yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahip PZR, real-time PZR gibi moleküler yöntemlerin yanlış sonuçları önlemek amacıyla kullanılmasının yararlı olabileceği düşünülmüştür. Asemptomatik ve farklı bulgulara sahip semptomatik olguların tümünde saptanan D. fragilis suşlarının aynı genotipe sahip olması, D. fragilis’in patojen ve apatojen farklı genotiplerinin olabileceğini düşündürmekte ve bu konuyla ilgili yapılacak yeni çalışmaların gerekliliğini göstermektedir.

* Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışma için Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Tıp Fakültesi Dekanlığı Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan izin alınmıştır (2017/1218).

Hasta Onayı: Çalışmamız kapsamında dışkı ve selofan bant örneği kullanılan tüm olgulara çalışma kapsamında bilgi verilmiş ve “Bilgilendirilmiş Gönüllü Olur Formu” doldurtturularak onayları alınmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulunda olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: İ.Y., E.M., H.E., Dizayn: S.E., E.M., Ö.G., H.E., Veri Toplanma veya İşleme: İ.Y., E.T., E.M., Analiz veya Yorumlama: İ.Y., Ö.G., H.E., Literatür Arama: İ.Y., S.E., Yazan: İ.Y., H.E.

Çıkar Çatışması: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemişlerdir.

Finansal Destek: ÖYP tez bütçesi tarafından desteklenmiştir.