GİRİŞ

Serbest yaşayan amiplerden biri olan Acanthamoeba cinsindeki türler, toprak, tatlı su kaynakları ve denizler gibi doğal ekosistemlerin yanı sıra havalandırma sistemleri, havuzlar, ameliyathaneler gibi insan yapımı alanlarda da yaşayabilmektedir (1-3). Ayrıca, kontakt lenslerden, lens saklama kapları ve solüsyonlarından da Acanthamoeba izole edilmiştir. Bu fırsatçı amip, merkezi sinir sistem hastalığı olan granülomatöz amibik ensefalitte (GAE), gözde görmeyi tehdit eden bir göz hastalığı olan Acanthamoeba keratitine (AK) ve özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde Acanthamoeba pnömonisi ve deri lezyonları gibi çeşitli klinik semptomlara yol açabilmektedir (4). Ayrıca, bu hastalıklar yalnızca insanlarda değil aynı zamanda da hayvanlarda görülmektedir (5). Köpek, sığır, kuş ve at gibi bazı hayvanlarda da bu fırsatçı patojenin enfeksiyonlara neden olabildiği bildirilmiştir (6-8).

Acanthamoeba’nın yaşam döngüsünde trofozoit ve kist olmak üzere iki formu vardır. Trofozoit formu aktif olarak beslenen, büyüyen, çoğalan ve hareket eden bir formudur. Kist formu ise olumsuz dış çevre koşullarına karşı daha dayanıklı olan formudur (1). Trofozoitler, sıcaklık ve pH uygun ve gıda yeterli ise yaşayabilirler. Ancak bu faktörlerin yokluğunda endokist ve ektokistten oluşan çift duvarlı bir kiste dönüşür. Zorlu koşullara dayanıklı olan kistler antibiyotiklere, klora ve dezenfektanlara karşı dirençlidirler. Koşullar tekrar uygun olduğunda, eksitasyon ile trofozoit formuna dönüşebilirler (1,9).

Acanthamoeba, özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda nadir görülen ancak ölümcül GAE’ye neden olur. GAE’nin ölüm oranı %97-98 civarındadır. Bugüne kadar, tüm dünyada yaklaşık 200’den fazla Acanthamoeba’nın neden olduğu GAE olgusu rapor edilmiştir (10). Amerika Birleşik Devletleri’nde her yıl Acanthamoeba’nın neden olduğu yaklaşık 10 GAE olgusu bildirilmektedir (11). Türkiye’de bugüne kadar Acanthamoeba’nın sebep olduğu toplam dört GAE olgusu rapor edilmiştir (12). Özellikle gelişmiş ülkelerde AK olgularının küresel insidans oranı artmaya devam etmekte olup ve en önemli risk faktörü olarak kontakt lens kullanıcıları olguların %85-88’ini oluşturduğu bildirilmiştir (13). Son zamanlarda, miyopi ve kozmetik amaçlı kontakt lens kullananların sayısı artmış ve kornea lazer refraktif cerrahi sonrası AK, nadir de olsa bildirilmiştir (14). Kontakt lens kullanımının daha az olduğu gelişmekte olan ülkelerde çoğu olgunun travma ile ilişkili olmasının yanı sıra, ana bulaş kaynağı kontamine su, toprak ve toz olduğu belirtilmiştir (13,15,16).

AK’nin erken teşhisi etkili tedavi için önemlidir. Ancak, AK sıklıkla başlangıçta herpes simpleks virüsü, bakteriyel veya fungal keratite benzerlik gösterdiğinden yanlış teşhis edilebilir. Bu yüzden tedavide gecikmeler olur ve sıklıkla önemli görme kaybına veya kornea nakli ameliyatına sebep olabilir (16). Acanthamoeba’nın klinik örneklerde tanısında mikroskobik inceleme, kültür yöntemi gibi yöntemlerle doğrudan patojenin varlığının tanımlanması hem zaman alıcı hem de teknik uzmanlık gerektiren bir yöntemdir. Ayrıca, bu yöntemler genellikle hassas, uygun veya kesin bir teşhis için yeterince uygulanabilir değildir (13,17). Acanthamoeba’nın saptanmasını daha da iyileştirmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), gerçek zamanlı PZR gibi moleküler yöntemler kullanılması daha yüksek hassasiyette ve daha kısa süre gerektirmesine rağmen pahalı laboratuvar ekipmanlarına duyulan ihtiyaç nedeniyle hala yaygın olarak kullanılmamaktadır (17-19). Bu nedenle Acanthamoeba tanısı için basit, hızlı ve hassas bir tanısal teste ihtiyaç olduğu düşünülmektedir.

Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) yöntemi teşhis amacıyla kullanılan ilk izotermal moleküler tabanlı bir yöntemdir. Bu yöntem, geleneksel DNA tabanlı teşhis yöntemlerine umut verici bir alternatiftir. Çünkü hızlı DNA amplifikasyonuna dayalı, basit ve oldukça yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip bir testtir. LAMP yönteminde izotermal koşullar altında Bacillus stearothermophilus DNA polimerazı ve spesifik olarak tasarlanmış 4-6 primer kullanarak bir saatten daha kısa sürede hedef DNA’nın 10⁹ kopya sayısına kadar çoğaltılabilmektedir (20). LAMP tekniğinde kullanılan primer sayısının PZR’de kullanılandan daha fazla olması amplifikasyonun özgüllüğünü ve hızını iyileştirir, böylece çoklu bantlardan oluşan tipik bir merdiven modeli üreten döngü yapılı bir amplikon oluşturur (21). Pozitif bir reaksiyon, bulanıklık olarak gözle kolorimetrik veya floresan boyaların eklenmesiyle kolayca belirlenir (22).

Bu çalışmada Acanthamoeba tanısını daha hızlı bir şekilde gerçekleştirmek için Acanthamoeba 18S rRNA gen bölgesine özgü primerler tasarlanarak hem kolorimetrik hem de floresan tabanlı hızlı LAMP testinin hassasiyetinin belirlenmesi amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Acanthamoeba Kültürü ve Hazırlanması

Bu çalışmada kullanılan Acanthamoeba suşu, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi’nde AK’li bir hastanın gözünden izole edilmiş ve bu izolat genotipi önceki çalışmamızda T4 (GenBank no: ON600789.1) olarak tanımlanmıştır (23). Kriyopreservasyon (-80 °C) işlemi ile saklanmış olan Acanthamoeba suşunu tekrar canlandırmak için daha önce hazırlanmış olan %1,5’lik non-nutrient agarın (NNA) inaktive edilmiş Escherichia coli (ATCC 25992) ile yüzeyi kaplanan agar plakların üzerine eklenerek 37 °C’de inkübe edilmiştir. NNA plaklarında çoğalma meydana geldikten sonra Acanthamoeba suşu aksenik kültür olan proteaz pepton %0,75, maya ekstresi %0,75 ve %1,5 glikoz içeren (PYG) ortamda 30 °C’de kültüre edilmiştir. Amipler toplanıp 500 g’de 10 dk santrifüj edilip ve PBS ile üç kez yıkanmıştır.

DNA İzolasyonu

Kültüre edilmiş Acanthamoeba’nın total genomik DNA’sı QIAamp DNA Mini Kit’i (Qiagen, Almanya) kullanılarak üretici firmanın protokolüne göre izole edilmiştir. Kısaca; 200 µL’sinde 1x10⁶ trofozoit içeren kültür sıvısı üzerine 20 µL proteinase K ve 200 µL buffer AL eklenip ardından 56 °C’de 10 dk inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra 200 µL etanol eklenip vorteks yapılıp ve QIAamp filtreli kolon tüplerine aktarılmıştır. Daha sonra QIAamp filtreli kolon tüpleri iki kez sırasıyla 500 µL Buffer AW1 ve Buffer AW2 ile yıkanmıştır. DNA’yı elde etmek için 100 µL Buffer AE eklenerek santrifüj yapılmıştır. Ekstrakte edilen DNA miktarı Nano-Drop spektrofotometre ile ölçüldükten sonra çalışılıncaya kadar -20 °C’de saklanmıştır.

LAMP Primer Tasarımı

Acanthamoeba’ya özgü 18S rRNA geni hedefleyen altı farklı bölgeyi tanıyan iki iç ve iki dış primer setleri PrimerExplorer V5 yazılımı (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html) kullanılarak tasarlanmıştır (Tablo 1). Tasarlanan primerlerin Acanthamoeba’ya spesifik olduğu, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) BLAST programı kullanılarak (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) kontrol edilmiştir.

LAMP Reaksiyonun Optimizasyonu

LAMP testinin optimizasyonu için ilk olarak Kolorimetrik LAMP reaksiyonları, WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG (New England Biolabs, Ipswich, ABD) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 25 µL LAMP reaksiyon içeriği; 12,5 µL WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master mix, 2,5 µL LAMP primer karışımı (final konsantrasyon FIP ve BIP: 1,6 µM, F3 ve B3: 0,2 µM, LF ve LB 0,4 µM), 1 µL total genomik DNA ve 9 µL nükleaz içermeyen su ile hazırlanmıştır. İkinci olarak, WarmStart Fluorescent LAMP (DNA&RNA) kiti (New England Biolabs, Ipswich, ABD) kullanılarak toplam hacmi 25 µL olan reaksiyon; 12,5 µL, WarmStart LAMP 2X Master mix, 2,5 µL LAMP primer karışımı (final konsantrasyon FIP ve BIP: 1,6 µM, F3 ve B3: 0,2 µM, LF ve LB 0,4 µM), 0,5 µL floresan boya, 1 µL total genomik DNA ve 8,5 µL nükleaz içermeyen su ile hazırlanmıştır. LAMP reaksiyonları termal blokta 59, 61, 63 ve 65 °C sıcaklıklarda optimal sıcaklığın ve sürenin belirlenmesi için 30, 45 ve 60 dakika olacak şekilde test edilmiştir. Elde edilen LAMP ürünleri %1 agaroz jel elektroforezi üzerinde yürütülüp ve SafeView Classic (Abm, Kanada) eklenerek DNR Bio-görüntüleme sistemleri altında görüntülenmiştir.

Acanthamoeba’nın Analitik Hassasiyeti

Kolorimetrik ve floresan LAMP testlerinin tanımlayabileceği minimum DNA miktarını belirlemek ve LAMP reaksiyonun duyarlılığının değerlendirmesi için, Acanthamoeba DNA’sının 10 kat seri sulandırmaları (1000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 pg/µL) kullanılmıştır. Kolorimetrik ve floresan LAMP reaksiyonları yukarıda tespit edilen (63 °C’de 60 dakika) optimal koşullara göre yapılmıştır. Kolorimetrik LAMP testinin sonuçlarının değerlendirilmesinde indikatörlerin pH değişikliğine bağlı olarak pembe renkten sarı renge dönüşmektedir. Böylece pembe renk negatif durumu gösterirken sarı renk pozitif durumu ifade edecek şekilde yorumlanmıştır. Floresan LAMP testinin değerlendirilmesinde ise ultraviyole (UV) ışığı altında floresan yansımalar incelenmiştir.

Ayrıca kolorimetrik LAMP testinin özgüllüğünü saptamak için diğer parazit etkenlerinden (Giardia intestinalis, Leishmania infantum, Blastocystis, Toxoplasma gondii ve Naegleria fowleri) elde edilen genomik DNA’lar LAMP ile amplifiye edilip %1 agaroz jel elektroforezi üzerinde yürütülmüştür.

İstatistiksel Analiz

Bu çalışmada istatistiksel analiz yapılmamıştır.

BULGULAR

Acanthamoeba Kültürü ve DNA İzolasyonu

Acanthamoeba suşu NNA plaklarında çoğalması görüldükten sonra aksenik kültür olan PYG besiyerine alınarak çoğalması için 30 °C’de inkübe edilmiştir. İnkübasyondan 7 gün sonra Acanthamoeba’nın %95’i trofozoit formunda ve %5’i ise kist fomunda tespit edilmiştir (Şekil 1). Amipler toplanıp hemositometre kullanılarak mikroskop altında sayılmıştır. Amipler DNA izolasyonu için 200 µL’de 1x10⁶ olacak şekilde hesaplanmıştır. DNA izolasyonu yapıldıktan sonra Nano-Drop spektrofotometre ile ölçülerek total genomik Acanthamoeba DNA konsantrasyonu 1000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 pg olacak şekilde sulandırılmıştır.

LAMP Primer Tasarımı

LAMP yöntemi ile Acanthamoeba’yı saptamak için PrimerExplorer V5 programı kullanılarak tasarlanan Acanthamoeba castellanii Neff suşun (GenBank No: U07416) 18S rRNA bölgesine özgü 6 LAMP primerleri Tablo 1’de gösterilmiştir. Tasarlanan primerlerin Acanthamoeba ile %100 benzerlik gösterdiği ve diğer parazitler ile benzerliği bulunmadığı online NCBI BLAST programı ile değerlendirilmiştir.

LAMP Reaksiyonun Optimizasyonu

LAMP’ın optimizasyonu için 30, 45 ve 60 dakika olacak şekilde 59, 61, 63 ve 65 °C sıcaklıklarda inkübe edilerek elde edilen LAMP ürünleri değerlendirilmiştir. Her ne kadar 45 dakikalık inkübasyonda LAMP ürünü gözlenmiş olsa da elde edilen ürünün rengi, pembe renk olan negatif kontrol ile karıştırılabilecek olan turuncuya dönüştüğü gözlenmiştir. Bu yüzden elde edilen sonuçlar hem kolorimetrik hem de floresan LAMP testinin 60 dakika süreyle 63 °C’de inkübasyonda en iyi ürün tespit edilmiştir. Kolorimetrik LAMP reaksiyonunda pozitif örneklerde pembeden sarıya bir renk değişimi görülürken, negatif örneklerde pembe olarak kalmıştır. Floresan LAMP reaksiyonunda pozitif örnekler UV ışık altında ışıma vererek tespit edilmiştir.

Acanthamoeba’nın Analitik Hassasiyeti

Nano-Drop Spektrofotometre ile ölçülen total genomik Acanthamoeba DNA konsantrasyonu 1000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 pg olacak şekilde farklı oranlarda sulandırılmıştır. Bir dizi sulandırılan örnekler ile yapılan LAMP reaksiyonu sonucunda kolorimetrik gözlemde 1, 10, 100 ve 1000 pg/reaksiyon tüplerinde rengin pembeden sarıya dönüştüğü gözlenmiştir (Şekil 2A) ve aynı şekilde floresan LAMP reaksiyon sonucunda da UV ışını altında 1, 10, 100 ve 1000 pg/reaksiyon tüplerinde ışıma gözlenmiştir (Şekil 3A). Ayrıca, LAMP ile pozitif olarak tespit edilen testin en düşük konsantrasyon %1’lik agaroz jel elektroforez üzerinde yürütüp oluşan bantlar ile test doğrulanmıştır (Şekil 2B, 3B). Böylece hem kolorimetrik hem de floresan LAMP testinin en düşük analitik hassasiyeti 1 pg/reaksiyon olarak tespit edilmiştir.

Çalışmamızda LAMP testinin özgüllüğünü değerlendirmek için Giardia intestinalis, Leishmania infantum, Blastocystis sp., Toxoplasma gondii ve Naegleria fowleri’nin DNA örnekleri kullanılmıştır. Kolorimetrik LAMP testinde pozitif kontrolde sarı renk görülür iken diğer örneklerde herhangi bir renk değişikliği olmayıp pembe renk olarak gözlenmiştir (Şekil 4A). Ayrıca, LAMP ürünü %1’lik agaroz jel elektroforezinde yalnızca pozitif kontrolde (Acanthamoeba T4 genotipi, GenBank no: ON600789.1) amplifiye ürünler görülürken diğer parazit DNA’larının ürünlerinde herhangi bir bant görülmemiştir (Şekil 4B).

TARTIŞMA

Acanthamoeba cinsinin birçok türleri ve bazı genotipleri dünyanın birçok yerinde yaygın olarak görülmektedir. Bu amipler suda, toprakta, havada, sebze ve meyvelerde, kontakt lens solüsyonlarında, hayvanlarda, insan dokuları ve boşluklarında tespit edilmiştir (1,4,24,25). Acanthamoeba insanlarda merkezi sinir sistemini etkileyen ciddi enfeksiyon olan GAE ve görmeyi tehdit eden AK’ye sebep olmaktadır. Ayrıca, kontakt lens takanlar için büyük bir risk olan AK’nin insidansının son yıllarda arttığı bildirilmiştir (4,16). Bu parazitin sebep olduğu hastalıkların teşhis edilmesi ve yönetilmesi oldukça zordur. Ayrıca, etkili bir tedavi sağlanabilmesi için hızlı, duyarlı, ucuz ve kolayca uygulanabilen ve yorumlanabilen sonuçlar sağlayan bir tanı yöntemi gerektirir. Özellikle AK tanısında erken tanı hayati önem taşımaktadır. Ancak, hastalığın erken klinik görünümü Herpes ve mantar enfeksiyonları ile kolay bir şekilde karışabilmektedir. Bu yüzden yanlış tanıya sebep olarak tedavinin gecikmesine sebep olmaktadır (26,27). Kornea kazıntı örneklerinin doğrudan yaymaları veya kültüre edilmiş örneklerinin mikroskobik tanımlanmaları, AK’nin laboratuvar teşhisinde oldukça yaygın kullanılan bir yöntemdir. Ancak, Acanthamoeba trofozoitleri ve kistlerinin genellikle kazınmış hücrelere veya hücre döküntülerine benzer olduğundan dolayı ayırt etmek zaman alıcı ve teknik uzmanlık gerektirmektedir. Konfokal mikroskopu, yakın zamanda, kültür ve mikrobiyolojik analizlere ihtiyaç kalmadan in vivo olarak enfeksiyonun hızlı teşhisini sağlamaktadır. Ancak bu yöntem her laboratuvar için uygun olmayan pahalı ve özel uzmanlık gerektiren bir araçtır (28,29). Bu nedenle, Acanthamoeba’nın laboratuvar tanısının için hassas, hızlı ve düşük maliyetli bir yöntem gereklidir. Bu çalışmada Acanthamoeba’nın 18S rRNA gen bölgesine özgü primerler tasarlanarak hem kolorimetrik hem de floresan görüntüleme yöntemleri kullanılarak hassas, ucuz ve hızlı LAMP testinin etkinliği gösterilmiştir.

Acanthamoeba’nın doku, kornea kazıntıları veya çevresel örneklerde tanımlamak için PZR ve genomik dizileme gibi yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, Acanthamoeba’nın teşhisi için kullanılan bu yöntemin reaksiyon süresinin uzun olması, maliyetinin yüksek ve karmaşık olması, pahalı laboratuvar cihazları gerektirmesi ve alanında uzman bir kişiye ihtiyaç duyulması açısından dezavantajları bulunmaktadır (19,30). Ancak, PZR’den daha ucuz ve daha verimli olan LAMP yöntemi, 2000 yılında Notomi ve ark. (20) tarafından geliştirilen nispeten yeni bir moleküler tekniktir. LAMP testi için dört primer hedefin altı farklı bölgesi için tasarlanan primerler sayesinde, hedef diziyi yüksek seçicilik ve özgüllükle çoğaltması beklenir. Hemen hemen tüm araştırmalarda LAMP tekniğinin özgüllüğünün %100’e yakın olduğu bildirilmiştir (21). Bakteriyel, viral ve paraziter enfeksiyonların moleküler tespiti dahil birçok klinik uygulama için LAMP tekniği başarılı bir şekilde rapor edilmiştir (31,32). LAMP, pahalı olmayan su banyosu gibi ucuz cihazlar ile gerçekleştirilebilmektedir. Ayrıca, PZR’de kullanılan agaroz jel elektroforezi gibi uygulamalara ihtiyaç duyulmamaktadır. Test sonucu oluşan renk değişikliği çıplak gözle veya floresan boya kullanarak değerlendirilebilmektedir (21,33).

Bu çalışmada Acanthamoeba’nın 18S rRNA genine özgü LAMP primerleri tasarlanmıştır. Acanthamoeba genomunda bu gen bölgesi cinse özgü olmasının yanı sıra genotipleme için de yaygın olarak kullanılan değişken bölgedir (19). Ayrıca, daha önceki çalışmalarda klinik ve çevresel örneklerin bu gen bölgesine ait primerlerin kullanılmasından dolayı bu çalışmada da bu bölge seçilmiştir (12,34-37).

Türkiye’de çeşitli çevresel ve klinik örneklerde bazı parazitlerin varlığı LAMP testi ile tespiti gerçekleştirilmiştir (38). Çevresel su örneklerinde Cryptosporidium ookistlerin varlığının tespit edilmesinde LAMP yönteminin PZR yönteminden daha duyarlı olduğu ortaya konmuştur (36). Ayrıca, çevresel su örneklerinde Toxoplasma gondii’nin B1 geni ile geliştirilen LAMP yöntemi ile 18S rRNA genine özgü PZR yöntemin karşılaştırılıp LAMP yönteminin daha duyarlı olduğu rapor edilmiştir (37). Başka bir çalışmada Toxoplasma gondii’nin RE gen bölgesine özgü LAMP primerleri tasarlanarak testin hassasiyeti 0,05 takizoit olarak tespit edilip PZR’ye göre RE gen bölgesi 1,000 kat daha hassas olduğu bildirilmiştir (32).

Acanthamoeba’nın tanısında altın standart olarak kültür yönteminin kabul edilmesine rağmen önceki çalışmalar LAMP testinin, direkt mikroskobik inceleme, kültür yöntemi ve PZR yöntemlerinden duyarlılığının ve özgüllüğünün daha yüksek olduğunu göstermiştir (39,40). Önceki çalışmalarda LAMP yönteminin duyarlılığı Acanthamoeba spp.’nin DNA’sı bir seri sulandırma ile değerlendirilip, 10 pg Acanthamoeba DNA’sı floresan boya ile UV ışık altında gösterilmiştir (41). Bir başka çalışmada ise in vitro olarak kültüre edilmiş Acanthamoeba türlerinden ekstrakte edilen DNA’ların seyreltilerek LAMP testinde minimum genomik DNA konsantrasyonu 1 pg Acanthamoeba DNA’sı floresan boya ile tespit edilmiştir (39). Çalışmamızda kültüre ettiğimiz Acanthamoeba’dan elde edilen DNA’ların bir seri seyreltildikten sonra minimun genomik DNA konsantrasyonu 1 pg olarak hem kolorimetrik hem de floresan boya ile tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçların daha hızlı ve hassas bir şekilde yorumlanabilmesi ve hasta başında uygulanabilir olması açısından kolorimetrik yöntem daha avantajlı olmaktadır. Ayrıca önceki çalışmalarda LAMP yönteminin PZR yönteminden 10 kat daha fazla duyarlı olduğu bildirilmiştir (41). LAMP yönteminin Acanthamoeba’yı tespit etmede örneklere ısıl işlem uygulanarak elde edilen DNA ile pozitif tespit edilirken PZR yönteminde sadece kit ile ekstrakte edilmiş DNA kullanıldığında etkili olduğu rapor edilmiştir (39). LAMP ve PZR sonuçları arasındaki bu fark LAMP yönteminde toplam altı primer kullanılarak çalışmasından dolayı daha yüksek hassasiyete sahiptir (42). Bundan dolayı DNA izolasyon basamağına ihtiyaç duymadan özgün primerler kullanılarak tasarlanan LAMP yöntemi ile Acanthamoeba’nın tanısı için gereken süre kısaltılabilir.

Acanthamoeba’nın 18S rRNA genine özgü tasarlanan primerler daha önceki çalışmalarda AK ile benzer klinik gösteren göz enfeksiyonlarına neden olabilecek mantar (Aspergillus fumigatus, Fusarium solani, ve Candida albicans), bakteri (Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia coli) ve viral (Herpes simpleks virüs tip 1) patojenler ile herhangi bir çapraz reaksiyon gözlenmediği rapor edilmektedir (39,40). Çalışmamızda LAMP testi için tasarlanan 18S rRNA genine özgü primerlerin çeşitli protozoanlar (Giardia intestinalis, Leishmania infantum, Blastocystis sp., Toxoplasma gondii ve Naegleria fowleri) ile herhangi bir çapraz reaksiyon gözlenmemiştir.

AK tanısında kullanılan kültür ve mikroskobik yöntemlerin her bir testi için yaklaşık 2,5 $ olması açısından en ucuz yöntem olarak önemli bir avantaja sahipken, testlerin uzun zaman alması ve uzman personel gerektirmesi dezavantajlarıdır. Moleküler yöntemlerin gelişmesiyle daha hızlı ve hassas olan PZR yöntemleri her bir test için yaklaşık maliyeti 16,4-30 $ olabilmekle birlikte gerekli olan zaman ise 120-150 dk arasında değişmekte ve pahalı laboratuvar cihazlarına gereksinim duyulmaktadır (43,44). Son yıllarda geliştirilen LAMP yöntemi ise daha duyarlı, hızlı ve ucuz olması açısından önemli bir moleküler testtir. Ayrıca tek bir su banyosu ile uygulanabilen ucuz bir yöntem olması, her bir test için yaklaşık 0,71-2 $ maliyetinin olması, sonuçların 60-90 dk arasında değerlendirmesi gibi avantajlara sahiptir (21). Çalışmamızda uyguladığımız LAMP testi ile 60 dk içinde sonuca varılmıştır. Bu şekilde hastalığın tanısında sonuçlara hızlı bir şekilde ulaşılması sağlanarak, erken tedaviye başlanmasına olanak sağlayacaktır.

SONUÇ

Çalışmamızda, tasarladığımız primerler kullanılarak yapılan LAMP testi Acanthamoeba’nın DNA’sının varlığını saptamada kullanılabilecek basit, ucuz ve yüksek hassasiyete sahip umut verici bir tekniktir. LAMP testi, tek bir ekipman ile minimum donanımlı laboratuvarlarda, saha ortamlarında ve hasta başında kullanım için basit, hızlı, uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu nedenle LAMP testi, AK tanısının hızlı bir şekilde teşhisine yardımcı olmak için laboratuvar test yöntemi olarak klinik uygulama için dikkate değerdir. Ayrıca, çevresel örneklerde Acanthamoeba tarama çalışmalarında daha hızlı bir şekilde uygulanabilir bir testtir.

Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışmada insan veya hayvanlar üzerinde herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Bu nedenle yerel etik kurul onayına gerek duyulmamıştır.

Hasta Onayı: Bu çalışma için geçerli değildir.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: M.A., M.K., M.D., Dizayn: M.A., M.K., H.C., A.D.D., Veri Toplama veya İşleme: M.A., H.C., M.K., Analiz veya Yorumlama: M.D., H.D., A.Y.G., H.C., M.A., Literatür Arama: M.A., M.K., Me.A., H.C., A.D.D., Yazan: M.A.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.