Özgün Araştırma

Dışkı Örneklerinde Cryptosporidium spp. Antijen Varlığının ELISA Yöntemi ile Araştırılması: Dokuz Yıllık Değerlendirme

10.4274/tpd.galenos.2020.6318

  • Yunus Emre Beyhan
  • Hasan Yılmaz

Gönderim Tarihi: 06.02.2019 Kabul Tarihi: 24.03.2020 Turkiye Parazitol Derg 2020;44(2):68-71

Amaç:

Cryptosporidium, dünya çapında insan ve birçok hayvan türünü etkileyen enterik bir protozoan parazittir. Dışkıda Cryptosporidium türlerinin teşhisinde genellikle özel boyama yöntemleri ya da dışkıda antijen aranmasına yönelik testler kullanılmaktadır. Bunlardan ELISA yönteminin pratikte yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahip olduğu bilinmektedir. Bu çalışmanın amacı Ocak 2010-Eylül 2018 yılları arasında laboratuvarımıza gönderilen dışkı örneklerde bu parazitin sıklığını ELISA yöntemi ile ortaya koymaktır.

Yöntemler:

Çalışma, Parazitoloji Laboratuvarı’na sindirim sistemi rahatsızlığı nedeniyle çeşitli polikliniklerden gönderilen 431’i erkek, 292’si kadın olmak üzere toplam 723 hasta üzerinde yürütülmüştür. Dışkı örnekleri rutin olarak Nativ-lugol yöntemiyle incelendikten sonra Cryptosporidium spp. antijen varlığı ELISA ile araştırılmıştır.

Bulgular:

Nativ-lugol yöntemiyle hiçbir hastada Cryptosporidium spp.’ye rastlanmazken, Cryptosporidium spp. antijen pozitifliği 723 hastanın %2,8’inde tespit edilmiştir. Çalışmada erkeklerin %2,5’inde ve kadınların %3,1’inde parazit saptanmış olup parazit sıklığı bakımından cinsiyetler arasında anlamlı bir fark olmadığı görülmüştür. Parazit pozitifliği en yüksek oranda (%4,5) 0-6 yaş grubunda saptanmıştır. Parazit sıklığı bakımından bu yaş gruplarının kendi arasında yapılan karşılaştırmalarında anlamlı bir fark belirlenmemiştir.

Sonuç:

Çalışmamızda saptanan yüksek cryptosporidiosis oranının, yöremizde hayvancılığın yaygın olması, hijyen kurallarına yeterince uyulmaması ve düşük sosyo-ekonomik düzey gibi faktörlerle ilişkili olduğu düşünülmektedir. Sonuç olarak çalışmamızın bulguları dikkate alındığında, intestinal şikayetleri olan hastaların ishalli ve/veya immünsüprese olup olmaması dikkate alınmadan Cryptosporidium spp. yönünden değerlendirilmesi doğru tanı açısından faydalı olacağı düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: Cryptosporidium, ELISA, Van, Türkiye

GİRİŞ

Cryptosporidium insanları da içine alan ve birçok omurgalı konakta hastalık meydana getirebilen enterik bir protozoan parazittir. Parazit sindirim ve solunum yollarını kapsayan epitel hücrelerinin mikrovillus bölgesinde yerleşerek enfeksiyona neden olur. Enfeksiyon kozmopolit bir yayılışa sahip olmakla beraber az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde daha da sık görülmektedir (1-4).

Bugüne kadar bu cinse ait 27 farklı tür memeliler, kuşlar, sürüngenler ve balık türlerinden izole edilmiştir. Enfeksiyon fekal-oral yolla insan ve hayvan dışkılarında bulunan ookistlerin gıda, hava, su ve yüzme havuzları yolu ile alınması ile bulaşmakta, hatta su kaynaklı büyük salgınlara da neden olabilmektedir. İnsan enfeksiyonlarının çoğundan iki Cryptosporidium türü (C. hominis ve C. parvum) sorumlu olmakla birlikte hayvanlarda görülen farklı türler de enfeksiyona yol açabilmektir (3-6).

Enfeksiyon başlıca diyare ile kendini gösterir. Daha az sıklıkla rastlanan diğer klinik belirtiler karın ağrısı, bulantı, kusma ve ateştir. Hastalığın kliniği kişiden kişiye değişmekle beraber sıklıkla atılan ookist miktarı, konağın immünitesi ve yaşı ile yakından ilişkilidir. Sağlıklı kişilerde genellikle asemptomatik seyreden veya 1-2 haftalık bir süreden sonra tedaviye gerek kalmaksızın genellikle kendiliğinden iyileşen enfeksiyon, özellikle çocuklar, beslenme yetersizliği olanlar, immünsüpresyonlu ve yaşlı kişilerde daha ağır klinik semptomlara neden olmaktadır (3,5,7,8). Cryptosporidium’un beş yaş altı çocuklarda ölümlerin %30-50’sinden sorumlu olduğu ve rotavirüs sonrası çocuklarda diyare ve ölümün en büyük ikinci nedeni olduğu tahmin edilmektedir (6). Tüm bu bilgilere rağmen cryptosporidiosis çok fazla bilinmemekte, başta korunma tedbirleri olmak üzere, teşhis ve tedavide yetersiz kalınmaktadır.

Enfeksiyon dışkı, mukus ve safra örneklerinde parazitin ookistlerini tanıyarak veya bağırsak dokusu biyopsisinde parazitin farklı evrelerinden birini görerek teşhis edilmektedir. Dışkıda Cryptosporidium türlerinin teşhisinde genellikle boyama yöntemleri ya da bu yöntemlerle beraber dışkıda antijen aranmasına yönelik testler tercih edilmektedir. Bunlar arasında sıklıkla kullanılan ELISA yöntemi oldukça pratik olup, yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahip olduğu bilinmektedir (7-9).

Bu çalışmanın amacı cryptosporidiosis şüphesi bulunan hastalarda, bu parazitin varlığını ELISA yöntemi ile ortaya koymaktır.


YÖNTEMLER

Bu çalışma, Ocak 2010 ile Eylül 2018 tarihleri arasında Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Laboratuvarı’na cryptosporidiosis şüphesi ile çeşitli polikliniklerden gönderilen 723 örnek üzerinde yürütülmüştür. Hasta onamları ve Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır (2019/04-04). Dışkı örnekleri rutin olarak Nativ-lugol yöntemiyle incelendikten sonra hiçbir koruyucu madde eklenmeden plastik tüpler içerisine alınarak kullanılıncaya kadar -20 °C saklanmıştır. Toplanan örnekler Cryptosporidium spp. antijen varlığı yönünden haftada bir gün toplu olarak rutin tanıda kullanılan ELISA yöntemiyle incelenmiş ve değerlendirme 450 nm. dalga boyunda gerçekleştirilmiştir. Testin uygulanması üretici firma (Ridascreen; R-Biopharm, Almanya) protokolüne uygun olarak yürütülmüştür. Cryptosporidium spp. için çalışılan negatif kontrol absorbans değerine 0,150 eklenerek cut-off değeri belirlenmiştir. Numunelerin absorbans değerleri cut-off değerinin %10 altındaysa negatif, %10 üstündeyse pozitif, bu değerler arasında ise sınır değer olarak kabul edilmiştir. Sınır değer olarak tespit edilen örnekler tekrar çalışılmıştır.

İstatistik analizde üzerinde durulan özellikler için tanımlayıcı istatistikler sayı ve yüzde olarak ifade edilmiştir. Çalışmamızda X2 testleri kullanılmış olup bütün hesaplamalar MINITAB (ver: 14) istatistik paket programında yapılmıştır. İstatistik anlamlılık düzeyi %5 olarak alınmıştır.


İstatistiksel Analiz

İstatistik analizde üzerinde durulan özellikler için tanımlayıcı istatistikler sayı ve yüzde olarak ifade edilmiştir. Çalışmamızda X2 testleri kullanılmış olup bütün hesaplamalar MINITAB (ver: 14) istatistik paket programında yapılmıştır. İstatistik anlamlılık düzeyi %5 olarak alınmıştır.


BULGULAR

Bu çalışma 431’i erkek, 292’si kadın olmak üzere toplam 723 hasta üzerinde yürütüldü. Nativ-lugol bakısı yapılan 723 örneğin hiçbirinde Cryptosporidium spp.’ye rastlanmadı, ancak ELISA ile örneklerin %2,8’inde (20 örnek) Cryptosporidium spp. antijen pozitifliği belirlendi. Yedi örnek (%1) ise sınır değerde tespit edilmiş, tekrar çalışılması sonucunda da örneklerin sınır değerde oldukları görüldü.

Çalışmada erkeklerin %2,5’i, kadınların %3,1’i pozitif bulunmuş olup parazit sıklığı bakımından cinsiyetler arasında anlamlı bir fark olmadığı görüldü (p=0,339) (Tablo 1).

Hastaların yaş aralıkları “0-6 yaş, 7-14 yaş, 15-24 yaş, 25-44 yaş, 45 ve üstü yaş” şeklinde gruplandırıldı ve bu yaş grupları sırasıyla 178, 160, 89, 175 ve 121 hastadan oluştu. Cryptosporidium antijen pozitifliği en yüksek %4,5 ile 6 yaş grubunda, en düşük pozitiflik ise %1,1 ile 15-24 yaş grubunda saptandı (Tablo 2). Fakat, pozitiflik ve yaş grupları arasında yapılan karşılaştırmada istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmedi (p=0,869).

2011 yılında 355, 2010 yılında 206 örnek incelenirken, 2012 yılında ise sadece 6 örnek incelendi. En yüksek Cryptosporidium spp. antijen pozitifliği 2014 yılında görülürken (%23,1), bazı yıllarda hiç pozitifliğe rastlanmamıştır (p=0,001) (Tablo 3).


TARTIŞMA

Cryptosporidium spp. enfeksiyonunun, özellikle iki yaşın altındaki çocuklarda, diyarelilerde, beslenme bozukluğu olanlarda, evcil hayvan besleyenlerde ve immünsüprese kişilerde daha sık görüldüğü bilinmektedir (2,4,8).

Bugüne kadar dünyada ve ülkemizde cryptosporidiosis yaygınlığı üzerine yapılan çalışmalarda farklı tanı yöntemleri kullanılmıştır. Bunlardan özel boyama yöntemleri ve ELISA gibi tanı yöntemlerinin daha yaygın olarak kullanıldığı görülmektedir. Enfeksiyonun en önemli klinik semptomu diyare olduğu ve immünsüprese hastalarda enfeksiyona daha sık rastlanıldığı için parazitin sıklığı üzerine yapılan çalışmalar daha çok bu olgular üzerinden yürütülmüştür.

Dünya genelinde yapılan çalışmalarda cryptosporidiosis sıklığı farklı hasta gruplarında araştırılmış ve farklı sonuçlar elde edilmiştir. Abaza ve ark. (10) 427 immünsüprese hastanın %6,3’ünde, Raja ve ark. (11) böbrek nakli yapılmış 644 hastanın %53’ünde, Sulzyc-Bielicka ve ark. (12) kolorektal kanserli 87 hastanın %12,6’sında, Al-Qobati ve ark. (13) 206 kanserli hastanın %30,1’inde, Kulkarni ve ark. (14) 137 ishalli AIDS hastasının %12’sinde enfeksiyona rastladıklarını bildirmişlerdir.

Ülkemizde de Cryptosporidium spp. enfeksiyonun genel toplumsal sıklığı ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır. Bu kapsamda, Börekçi ve ark. (15) gecekondu mahallesinde yaşayan 361 kişinin %3,1’inde, Otağ ve ark. (16) 8-12 yaş grubu 72 ilkokul öğrencisinin %5,5’inde, yaşları 19-71 arasında değişen ve klinik olarak asemptomatik 100 kişinin %3’ünde parazite saptamışlardır (17). Ülkemizde immünsüprese hastalar üzerinde parazitin sıklığının araştırıldığı çalışmalarda; Tanyüksel ve ark. (18) 106 neoplastik hastanın %16,9’unda, Ok ve ark. (19) kronik böbrek yetmezliği olan 46 hemodiyaliz hastasının %30,4’ünde, Sarı ve ark. (20) yine kronik böbrek yetmezliği olan 47 hastanın %6,4’ünde, Karlı ve ark. (21) ishalli ve immünitesi normal 229 çocuğun %5,6’sında, 11 immün yetmezlikli hastanın %27’sinde Cryptosporidium spp. pozitifliği belirlemişlerdir. Yine ülkemizde ishalli hastalarda yapılan çalışmalarda; Çiçek ve Yılmaz (22) 450 çocuğun %2,2’sinde, Atambay ve ark. (23) 500 hastanın %1,6’sında enfeksiyona rastlamışlardır. Genel olarak görüldüğü üzere ishalli ve immünsüprese hastalarda parazite daha yüksek oranlarda rastlandığı görülmektedir (22-24).

Yaptığımız bu çalışma ise sindirim sistemi şikayeti ile farklı kliniklere başvuran ve rutin olarak laboratuvarımıza gönderilen hastaların dışkı örnekleri, sadece Nativ-lugol ve ELISA yöntemleri ile değerlendirilmiştir. Hastalığın tanısında boyama yöntemlerinin uygulanması kesin tanı için gerekli olmakla birlikte, laboratuvar personel sayısının yetersiz olması nedeniyle rutin tanıda Modifiye Kinyoun asit-fast gibi özel boyama yöntemleri uygulanamamakta, sadece bilimsel çalışmalar ve özel istek dahilinde bu yöntemlere başvurulmaktadır. Wang ve ark. (25) hastaların %2,36’sında Cryptosporidium ookistlerine rastlarken, ELISA ile hastaların %21,81’inde; Yılmaz ve ark. (24), modifiye asit-fast boyama ile 2000 çocuğun %1,95’inde, ELISA yöntemi ile %4,9’unda; yine Tamer ve Gülenç (9) gastrointestinal şikayetleri olan 80 hastanın boyama yöntemi ile %3,75’inde, ELISA yöntemi ile %6,25’inde enfeksiyonu tespit etmişlerdir. Cryptosporidium ookistlerinin direk mikroskobi ile görülmesi pratik olarak mümkün olmadığı için, bu çalışmada Nativ-lugol ile 723 hastanın hiçbirinde parazite rastlanmazken, ELISA testi ile hastaların %2,8’inde parazit antijeni tespit edilmiştir. Yedi örnek ise sınır değerde tespit edilmiş, bunun özellikle apikompleksan parazitler gibi farklı mikroorganizmalarda mevcut ortak antijenlere karşı gösterilen çapraz reaksiyondan kaynaklanabileceğini düşündürmüştür. Boyama yöntemleri uygulanamamış olsa da hasta sayısının fazla olması, çalışmanın uzun bir zaman aralığını kapsaması ve elde edilen oranın görece yüksek olması nedeniyle çalışma sonuçlarının önemli olduğu düşünülmektedir.

Cryptosporidium spp. sıklığının belirlendiği çalışmalarda çoğunlukla yaş grupları ve cinsiyetler arasında istatistik değerlendirme yapılmamıştır. Yapılan bir çalışmada bu kriterler istatistik olarak karşılaştırılmış ve çalışmamızda olduğu gibi parazit sıklığı bakımından anlamlı bir fark belirlenmemiştir (21). Her ne kadar istatistiksel olarak anlamlı bulunmasa da diğer yaş gruplarına kıyasla 0-6 yaş grubunda daha yüksek pozitifliğe rastlanmıştır. Çalışmamızda yıllara göre yapılan bakı sayısı incelendiğinde, 2010 ve 2011 yıllarında oldukça fazla sayıda hasta örneğinin incelendiği dikkat çekmektedir. Bunun sebebinin, o dönemlerde farklı kliniklerde görev yapan ilgili hekimlerde kişisel olarak Cryptosporidium farkındalığı olması ve parazit şüphesi ile laboratuvarımıza gönderilen örnek sayısının artmasından kaynaklandığı düşünülmektedir.


SONUÇ

Çalışmamızda saptanan yüksek cryptosporidiosis oranının, yöremizde hayvancılığın yaygın olması, hijyen kurallarına yeterince uyulmaması ve düşük sosyo-ekonomik düzey ile olabileceği düşünülmektedir. Sonuç olarak çalışmamızın bulguları dikkate alındığında, intestinal şikayetleri olan hastaların ishalli ve/veya immünsüprese olup olmaması dikkate alınmadan Cryptosporidium spp. yönünden değerlendirilmesi doğru tanı açısından yararlı olacaktır.

* Etik

Etik Kurul Onayı: Hasta onamları ve Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır (2019/04-04).

Hasta Onayı: Sözlü hasta onamı bu çalışmaya katılan hastalardan alınmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: Y.E.B., H.Y., Dizayn: Y.E.B., H.Y., Veri Toplama veya İşleme: Y.E.B., H.Y., Analiz veya Yorumlama: Y.E.B., H.Y., Yazan: Y.E.B., H.Y.

Çıkar Çatışması: Yazarlar çıkar çatışması bildirmemişlerdir.

Finansal Destek: Yazarlar bu çalışma için finansal destek almadıklarını beyan etmişlerdir.


Resimler

  1. Xiao L, Fayer R, Ryan U, Upton SJ. Cryptosporidium taxonomy: Recent advances and implications for public health. Clin Mıcrobiol Rev 2004;17:72-97.
  2. Fayer R, Ungar BLP. Cryptosporidium spp. and criptosporidiosis. Microbiol Rev 1986;50:458-83.
  3. Caccio SM, Widmer G. Cryptosporidium: Parasite and Disease. New York: Springer Wien Heidelberg; 2014.
  4. Dillingham RA, Lima AA, Guerrant RL. Cryptosporidiosis: epidemiology and impact. Microbes Infect 2002;4:1059-66.
  5. Adal KA, Sterling CR, Guerrant RL. Cryptosporidium and related species. In: Blaser MJ, Smith PD, Ravdin JI, Greenberg HB, Guerrant RL, editors. Infections of the Gastrointestinal Tract. New York: Raven Press; 1995. p.1107-28.
  6. Ryan U, Hijjawi N. New developments in Cryptosporidium research. Int J Parasitol 2015;45:367-73.
  7.  Korkmaz M, Ok ÜZ. Parazitolojide Laboratuvar. İzmir: Meta Basım; 2011.
  8. Özcel MA, Özbel Y, Ak M. Özcel’in Tıbbi Parazit Hastalıkları. İzmir: Meta Basım; 2007.
  9. Tamer GS, Gülenç S. The investigation of the presence of antibodies for Cryptosporidium spp. in fecal samples using ELISA. Acta Parasitol Turcica 2008;32:198-201.
  10. Abaza SM, Makhlouf LM, El-Shewy K, El-Moamly A. Intestinal opportunistic parasites among different groups of immunocompromised hosts. J Egypt Soc Parasitol 1995;25:713-27.
  11. Raja K, Abbas Z, Hassan SM, Luck NH, Aziz T, Mubarak M. Prevalence of cryptosporidiosis in renal transplant recipients presenting with acute diarrhea at a single center in Pakistan. J Nephropathol 2014;3:127-31.
  12. Sulzyc-Bielicka V, Kolodziejczyk L, Jaczewska S, Bielicki D, Kladny J, Safranow K. Prevalence of Cryptosporidium sp. in patients with colorectal cancer. Pol Przegl Chir 2012;84:348-51.
  13. Al-Qobati S, Al-Maktari M, Al-Zoa A, Derhim M. Intestinal parasitosis among Yemeni patients with cancer, Sana’a, Yemen. J Egypt Soc Parasitol 2012;42:727-34.
  14. Kulkarni S, Kairon R, Sane S, Padmawar P, Kale V, Thakar M, et al. Opportunistic parasitic infections in HIV/AIDS patients presenting with diarrhoea by the level of immunesuppression. Indian J Med Res 2009;130:63-6.
  15. Börekçi G, Otağ F, Emekdaş G. Mersin’de bir gecekondu mahallesinde yaşayan ailelerde Cryptosporidium prevalansı. İnfeksiyon Derg 2005;19:39-46.
  16. Otağ F, Aslan G, Emekdaş E, Aydın E, Taylan Özkan A, Çeber K. Mersin ilinde ilkokul öğrencilerinde Cryptosporidium spp. ookistlerinin araştırılması. Türkiye Parazitol Derg 2007;31:17-9.
  17. Türegün Özdemir E, Tanyüksel M, Kuştimur S, Araz E, Uygun A, Can C, et al. Cryptosporidiosis açısından asemptomatik olan bireylerde Cryptosporidium parvum araştırılması. Gülhane Tıp Derg 2002;44:249-53.
  18. Tanyüksel M, Gün H, Doganci L. Prevalence of Cryptosporidium sp. in patients with neoplasia and diarrhea. Scand J Infect Dis 1995;27:69-70.
  19. Ok ÜZ, Korkmaz M, Ok GE, Özkan AT, Ünsal A, Özcel MA. Kronik böbrek yetmezliğinde cryptosporodiosis ve blastocystosis. Türkiye Parazitol Derg 1996;20:41-9.
  20. Sarı C, Sarı K, Ertuğ S. Kronik böbrek yetmezliği olan hastalarda Cryptosporidium spp. ve Blastocystis hominis sıklığının araştırılması. Türkiye Parazitol Derg 2003;27:187-90.
  21. Karlı A, Metin A, Ergen S, Şimşir H, Köse G. İshalli çocuklarda Crptosporidium sıklığı. Çocuk Enf Derg 2013;7:92-6.
  22. Çiçek M, Yılmaz H. İshalli çocuklarda Cryptosporidium spp. ve diğer barsak parazitlerinin yaygınlığı. Dicle Tıp Derg 2011;38:70-5.
  23. Atambay M, Daldal N, Çelik T. Malatya’da ishalli dışkılarda Cryptosporidium spp. araştırılması. Türkiye Parazitol Derg 2003;27:12-4.
  24. Yilmaz H, Tas-Cengiz Z, Cicek M. Investigation of cryptosporidiosis by enzyme-linked immunosorbent assay and microscopy in children with diarrhea. Saudi Med J 2008;29:526-9.
  25. Wang QQ, Guo JD, Cao ZG, Wang QZ, Liu DH, Wang TP. Investigation on human Cryptosporidium infection in local area of Anhui Province. Zhongguo Xue Xi Chong Bing Fang Zhi Za Zhi 2015;27:263-7.