Özgün Araştırma

Alveolar Ekinokokkoz Tanısında ELISA (Em2- Em18) ve Western Blotting Yöntemlerinin Kullanımı

10.4274/tpd.galenos.2019.6447

  • Mehtap Demirkazık
  • İsmail Soner Koltas
  • Tonay İnceboz
  • Metin Korkmaz
  • Derya Gümürdülü

Gönderim Tarihi: 29.05.2019 Kabul Tarihi: 21.08.2019 Turkiye Parazitol Derg 2019;43(1):13-17

Amaç:

Alveolar ekinokokkoz (AE) kuzey yarım kürenin ölümcül parazitik zoonozlarından biri olup erken tanı konulması ve tedaviye başlanması hayatta kalma olasılığını arttırmaktadır. Bu çalışmada, çeşitli hastalıklardan tanı almış 50 hastanın serum örneği iki farklı serolojik tanı yöntemi ile değerlendirilmiştir.

Yöntemler:

Çalışmada, Em2-Em18 ELISA (Bordier Affinity Products, Crissier, Switzerland) ve Echinococcus Western Blot immünoglobulin G (IgG) (LDBIO Diagnostics, Lyon, France) yöntemleri kullanılmıştır.

Bulgular:

Em2-Em18 ELISA ile patolojik olarak AE tanılı 10 hastanın dokuzunda, kistik ekinokokkoz (KE) tanılı 21 hastanın ikisinde, 2 fascioliasis tanılı hastanın birinde ve bir kronik hepatitli hastada yüksek titrede antikor saptanmıştır. Doğrulayıcı test olarak kullanılan Echinococcus Western Blot IgG testi ile 10 AE hasta serumunun tamamı pozitif olarak değerlendirilirken KE hastalarının %85,7’sinde (18/21) IgG antikoru saptanmıştır. Hepatit hastasında ve kazeifiye granülomatöz enflamasyon görülen hastada ise bu yöntemle yanlış tanıya rastlanmıştır. Karaciğer ile ilgili hastalıkları olan ve diğer paraziter kaynaklı hastalıkları olan hastalardan alınan örnekler ise negatif olarak saptanmıştır.

Sonuç:

Çalışmada uygulanan serolojik yöntemler, endemik bölgelerde özellikle AE’nin erken tanısında ve sero-epidemiyolojik çalışmalarda kullanılabilirlik açısından önemli bulunmuştur.

Anahtar Kelimeler: Alveolar ekinokokkoz, serolojik tanı, ELISA, Western Blotting

GİRİŞ

Ekinokokkoz, taenia sestod Echinococcus cinsinin sebep olduğu zoonotik parazitik bir enfeksiyondur. İnsanda hastalık oluşturduğu bilinen dört tür Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, E. vogeli ve E. oligarthrus’dur (1). İlk ikisi Türkiye’de önemli halk sağlığı problemi oluşturmaktadır. Alveolar ekinokokkoz (AE) tilki şeridi E. multilocularis’in larval formu metasestodun sebep olduğu, yaşamı tehdit eden bir zoonoz olup erken tanı sonrası tedavi edilmezse ölümcül olabilmektedir (2). E. multilocularis’in devam eden yaşam döngüsünde son konak Vulpes cinsi tilkiler iken ara konak Arvicolidae ailesine bağlı kemiricilerdir. Köpek ve ayrıca kediler de ara konaklarla beslendiklerinde son konak olabilir. İnsan sestod yumurtalarını sindirim yolu ile aldığında rastlantısal ara konak olarak enfekte olur (3). Metasestod dışa doğru infiltratif sınırsız proliferativ kapasite ile yavaşça gelişir. Uzun asemptomatik periyod ve tümör benzeri multiveziküler yapıda invaziv karakterli infiltratif yıkımlayıcı gelişen, uzak organlara metastaz yapabilen sekonder lezyonlar akciğer veya beyin gibi organlarda da ciddi enfeksiyonlar meydana getirebilir. Tedavi edilmeyen hastalarda tanı konulduktan 10 yıl sonra mortalite oranı %95 olarak bildirilmiştir (4).

AE olguları Kuzey Amerika, Avrupa ve Asya’da kuzey yarım kürede sınırlanmıştır (5). Endemik bölgeler içinde Orta Avrupa, Japonya’ya uzanan kuzey ve Orta Asya ve Kuzey Amerika bulunur (6). Türkiye’de insanda ilk olgu 1872’de, kesin konakta ise 1965’de bildirilmiştir (7). 1872-1995 yılları arasında 180 AE hastası bildirilmiştir (7). 2007 yılına kadar 430 olgu (8)  ve 2000-2010 yıllarında 162 yeni olgu bildirilmiştir (9). AE olgularının bölgesel olarak %86’sı Doğu ve Güney Doğu Anadolu Bölgesi’nde yaşadıkları görülmüştür. Organ yerleşiminin %95 oranında karaciğerde olduğu bildirilmiştir. Çukurova’dan 6 olgunun serolojik tanısı immünoblotting yöntemi ile 70 ve 90 kDa bantlarla tanımlanarak konulabilmiştir (10). AE’de erken tanı ve tedavi yaşamsal önem taşımaktadır (11). Avrupa ve Asya’da yapılan son çalışmalar AE endemik bölgelerinin daha önce bilinen oranlara kıyasla arttığını göstermiştir. E. multilocularis kırsal alandan şehirlere doğru genişlemiştir.

Echinococcus spp. spesifik serum antikoru testleri ile yüksek oranda duyarlılık ve hassasiyette tanımlanabilir (12). Yıllar içerisinde tanı yöntemlerinin gelişmesi ile AE hasta sayısının arttığı görülmektedir. AE tanısı temel olarak klinik bulgular, epidemiyolojik veriler, ultrason (US), bilgisayarlı tomografi (BT), manyetik rezonans (MR) gibi görüntüleme yöntemleri ile uyumlu lezyon morfolojisi ve immün tanı testleri ile yapılmaktadır. Kesin tanı yöntemi histopatolojik incelemeye dayalıdır (13). Gelişen moleküler tanı yöntemlerinden kesin tanıda önemli ölçüde faydalanılmaktadır (14). Bu çalışmada, AE serolojik tanısında ELISA ve Western Blotting (WB) yöntemlerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır.


YÖNTEMLER


Serum Örnekleri

Bu çalışmada 2009-2012 yılları arasında elde edilmiş tedavi öncesi patolojik olarak AE tanısı alan 10 hasta serumu yanı sıra çapraz reaksiyon görülüp görülmeyeceğine bağlı paraziter veya diğer hastalıkları içeren hasta serumları ve US görüntülemesinde karaciğerlerinde kitle görülmeyen sağlıklı kontrol grubu olmak üzere toplam 50 serum örneği kullanılmıştır. Diğer parazitik hastalıklara ait serum örnekleri olarak ise, 21 kistik ekinokokkoz (KE), 2 visseral leishmaniasis, 2 tropika sıtması, 2 amebiyazis (E. histolytica), 2 fascioliasis, 1 toksoplazmoz ve 1 toksokaryaz hastasından alınan örnekler; diğer karaciğer hastalıklarına ait örnekler olarak da 1 karaciğer yağlanması olan, 1 kronik hepatit tanısı almış ve 1 kazeifiye granülomatöz inflamasyon tanısı almış hasta örnekleri kullanılmıştır.  Kontrol olarak ise, görüntüleme yöntemleri ile karaciğerlerinde lezyon görülmeyen 6 sağlıklı bireyden alınan serum örnekleri çalışmaya dahil edilmiştir. Çalışılan 50 serum örneğinden 6 AE, 6 KE ve 4 sağlıklı kontrol örneği Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı’ndan diğer serum örnekleri ise Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’na ulaşan serum örneklerinden elde edilmiştir.


Em2-Em18 ELISA Yöntemi

Tarama testi olarak E. multilocularis Em2-Em18 antijen ile kaplı ELISA testi uygulanmıştır. Üretici firma (Bordier Affinity Products, Crissier, Switzerland) uyarıları dikkate alınarak negatif, zayıf pozitif, pozitif kontrol ve 50 serum örneği aynı laboratuvar koşullarında birlikte çalışılmıştır. Zayıf pozitif kontrol optik dansite sonucu eşik değer olarak kabul edilmiştir. Negatif, zayıf pozitif ve pozitif kontroller tris-tamponlu salin (TBS)-Tween ile 1/20 oranında, diğer serum örnekleri ise 1/200 oranında TBS-Tween ile sulandırılmıştır. Kontroller ve serum örnekleri çalışılacak kuyulara TBS-Tween eklenerek 15 dakika inkübasyona tabi tutulmuş, döküldükten sonra ilk kuyuya 100 µL TBS-Tween, 100’er µL sulandırılmış kontroller, 100 µL sulandırılmış serum örnekleri sırası ile eklenip 30 dk 37 °C’de inkübasyona bırakılmıştır. Süre sonunda 4 kez yıkama yapılıp 100 µL sulandırılmış protein A-alkalin fosfataz konjugatı eklenmiş ve yine 30 dk 37 °C’de inkübasyona bırakılmıştır. Yıkama işlemi tekrarlandıktan sonra 100 µL substrat eklenerek 30 dk 37 °C’de inkübasyona bırakılmış, süre sonunda her kuyuya 100 µL durdurma solüsyonu eklenerek ELISA okuyucusunda (ST-360 Microplate Reader) 405 nm de okutulmuştur.


Western Blotting Yöntemi

Bu yöntem, üretici firma (LDBIO Diagnostics, Lyon, France) uyarıları dikkate alınarak çalışma programı (strip numaraları ve serum örnekleri numaraları kodlanarak)  düzenlenmiştir. Ayrı kanalları bulunan inkübasyon tepsisine pudrasız eldiven kullanarak stripler dikkatlice birbirinden ayrılarak her bir strip bir kanala gelecek şekilde dağıtılmıştır. Dakikada 10 döngü yapan sallayıcı (Shaker, Nüve SL 350) 1,2 mL buffer ile 5-10 dk striplerin ıslanması sağlanmıştır. Düzenlenen sıraya göre pozitif kontrol ve serum örneklerinden 50 µL eklenerek 90 dk sallayıcıda bırakılmıştır. Tüm kanallardaki sıvılar aspire edilerek 3 kez yıkama işlemi yapılmıştır. Konjugat eklenerek 60 dk inkübe edilerek yıkama işlemi tekrarlanmıştır. Kanallara bromo chloro indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium içeren substrat eklenip üzeri alüminyum folyo ile kaplanmış ve 20 dk sonrasında renk oluşumu 5 dk ara ile kontrol edilmiştir. Kanallardan sıvı aspire edildip distile su ile renk değişimi durdurulmuş ve stripler havada kurutulmuştur.


BULGULAR

Patoloji sonuçlarına göre kesin tanı almış 10 AE hasta serumlarının dokuzunda Em2-Em18 ELISA ile AE tanısı yapılmıştır. Ayrıca, 2 KE, 1 fasioliasis ve 1 kronik hepatitli hasta serumunda zayıf pozitif üzeri değere rastlanmıştır. AE için testin duyarlılığı ve özgüllüğü %90, pozitif prediktif değeri %69,2  negatif prediktif değeri %97,3 olarak belirlendi.

Serum örneklerine uygulanan WB yöntemi üretici firmanın tanımladığı beş farklı (P1-P5) kalıpla değerlendirilmiştir (Tablo 1). Strip üzerinde oluşan bantlara göre sonuçlar aşağıdaki kriterlere göre değerlendirilmiştir.Patoloji sonuçlarına göre AE olarak tanımlanmış bütün hastaların serum örnekleri P3 kalıbında tanımlanırken P1 kalıbında 5 (%23,8) KE hastası, P2 kalıbında 12 (%57,1) KE hastası tanımlanmıştır. Bir (%4,7) KE hastası P5 kalıbı ile uyumlu iken 3 KE hastası negatif bulunmuştur. Ayrıca kronik hepatit hastası P5 ve kazeifiye granülomatöz enflamasyon tanısı alan bir hasta P4 kalıbında pozitif sonuç vermiştir. Diğer paraziter hastalıklarda, karaciğer yağlanması tanısı alan ve negatif kontrol serum örneklerinde ise herhangi bir bant görülmemiştir.

WB yöntemi Echinococcus spesifik antikorları %90,3 (28/31) oranında tanımlarken E. granulosus ve E. multilocularis serolojik ayrımı %87 (27/31) oranında gerçekleşmiştir. Duyarlılık ve özgüllük WB’de %100 bulunurken kazeifiye granülomatöz enflamasyon tanısı alan hasta serumu ve kronik hepatit tanısı alan hasta serumları Echinococcus spesifik (P4, P5) kalıbında bulunmuştur. Şekil 1’de AE tanısında ELISA ve WB yöntemleri uygulanan serum örneklerinin sonuçları, Tablo 2’de WB tanımlanan kalıplar ve ELISA değerlendirilmesi, Şekil 2’de ise WB pozitif kontrol, negatif kontrol, P3 ve P2 kalıp görüntüleri verilmiştir.


TARTIŞMA

Bu çalışmada, erken tanının yaşamsal önemi olan AE hastalığında Em2-Em18 ELISA ve WB yöntemlerinin rutin laboratuvarlarda uygulanabilirliğinin belirlenmesi hedeflenmiştir. AE tanısında, başta kist yapısının radyolojik yöntemler (US, BT ve MR) yardımı ile görüntülenmesi ve histopatolojik incelenmesinin yanı sıra immunolojik testlerden de faydalanılmalıdır. Serolojik yöntemler olarak tanımladığımız immünolojik tekniklerden özellikle yeni geliştirilen antijenlerle hazırlanan ELISA ve WB yöntemleri rutin tanıda önem arz etmektedir. Ülkemiz AE’de yeni olguların bildirilmesi sebebiyle endemik bölge olarak kabul edilmiştir. Türkiye gibi endemik bölgelerde yapılacak sero-epidemiyolojik çalışmalarda erken tanı ELISA ve Echinococcus WB immünoglobulin G (IgG) yöntemleri ile sağlanabilir. Bu amaçla tarama testi olarak ELISA ve karşılaştırma amaçlı olarak da Echinococcus WB IgG uygulanabilir (3).

Araştırıcılar ELISA yönteminin verimliliğinin değişik coğrafi orijinli parazit izolatlarına bağlı olduğunu bildirmişlerdir. İmmün tanıda ELISA yöntemi uygulanarak, İsviçre ve Fransa orjinli hasta serumlarında duyarlılık %96, Alaska ve Japon hasta serumlarında %100 olarak bildirilmiştir (15-17). Bu çalışmada Türkiye orjinli hasta serum örneklerinin duyarlılığı %90 olarak saptanmıştır. Ayrıca benzer yönde fascioliasis ve KE hasta serumunda Em2-Em18 ELISA yöntemi ile çapraz reaksiyon görülmüştür. Ek olarak bu çalışmada kronik hepatit tanısı alan bir hasta serumu da pozitif olarak bulunmuştur.

Echinococcus WB IgG yöntemi Echinococcus cinsinde KE ve AE ayrımını yaparken, ELISA yöntemi ile sadece AE tanısı yapılmıştır. Ülkemiz gibi AE ve KE ile endemik coğrafi bölgelerde ayrıcı tanının önemi büyüktür (18).

Yapılan çalışmalardan Echinococcus WB IgG yöntemi ile E. vogeli hasta serumlarında ve E. multilocularis’e homolog antijen varlığı ile P3 kalıbında görüldüğü bildirilmiştir. Bir nörosistiserkoz hasta serumu da P3 kalıbında tanımlanmıştır. Üç Schistosoma mansoni ile enfekte hasta serumu P1 kalıbında tanımlanarak çapraz reaksiyon görülmüştür. Bizim çalışmamızda kronik hepatit hasta serumu P5 ve kazeifiye granülomatöz enflamasyon hasta serumu P4 olarak tanımlanmıştır. Diğer paraziter hasta serumlarında çapraz reaksiyona rastlanmamıştır. Benzer şekilde araştırmacılar ekinokokkoz hastalarını %97 oranında tanımladığını belirledikleri halde (19), çalışmamızda bu oran %90 oranında bulunmuştur. Tür ayrımının ise %76 oranında yapıldığı belirtilirken (19), çalışmamızda %87 oranında olduğu görülmüştür.

Diğer bir çalışmada ise iki atipik ekinokokkoz hasta serumu örneğinde serolojik tanıda uygulanan E. granulosus hidatik kist sıvısı kullanılarak yapılan in-house ELISA ve Echinococcus WB IgG testleri aynı zamanda PCR ve histoloji bulguları ile karşılaştırılmıştır. PCR ile E. multilocularis tanımlanan hasta serumlarında bir hasta ELISA ile pozitif Echinococcus WB IgG ile E. multilocularis olarak tanımlanmış, ikinci hasta ise ELISA ile negatif iken Echinococcus WB IgG ile KE olarak tanımlanmıştır (20). Kürativ rezeksiyon sonrası birçok hasta serumunda ELISA yöntemi ile antikor tanımlanamamıştır (21). Echinococcus WB IgG yöntemi AE hastalarının farklı klinik evrelerinin takibinde uygun bir yöntem olduğu rezeksiyon sonrası 16-18 kDa bantların 1-4 yıl sonra kaybolduğu bildirilmiştir (22). Korkmaz ve ark. (23) tarafından yapılan bir çalışmada Echinococcus WB IgG yöntemi AE için 70-90 kDa bantları çok yüksek sensitivite ve spesifiteye sahip bantlar elde edildiği bildirilmiştir. Çalışmamızda şüpheli hasta serum örnekleri tedavi öncesi alınmıştır.

Çalışmamızda uygulanan ELISA yöntemi, patolojik tanı ile karşılaştırıldığında sensitivitesi ve spesifitesi %90 olarak saptanırken, pozitif prediktif değeri %69,2 ve negatif prediktif değeri %97,3 olarak bulunmuştur. Endemik bölgelerde yaşayan ya da bu bölgelere bir süreliğine gidenlerde uygulanabilecek maliyeti düşük, kısa sürede çok sayıda şüpheli hasta serumu çalışılacak kolay yorumlanabilir duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek güvenilir tarama testi olduğu görülmüştür. Doğrulama testi olarak WB uygulanarak tanının desteklenebileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, Türkiye orjinli hasta serumlarında karşılaştırmalı olarak ELISA ve Echinococcus WB IgG testi çalışılmıştır. Yapılacak epidemiyolojik çalışmalarda büyük sayıda şüpheli hasta serumlarının farklı klinik evrelerdeki takiplerde çalışılması önerilebilir.


SONUÇ

Sonuç olarak AE ve KE’nin endemik olarak  birlikte görüldüğü ülkelerde serolojik tanıda Echinococcus WBIgG yöntemi çalışılabilir. Endemik bölgelerde AE’un rutin tanısında ELISA ve Echinococcus WB IgG yöntemleri yararlı ve güvenilir olarak bulunmuştur.

* Etik

Etik Kurul Onayı: Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültsi’nden 30.06.2009 tarihi ile etik kurul onayı alınmıştır.

Hasta Onayı: Hasta onayı alınmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu içinde olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: İ.S.K., M.D., Dizayn: İ.S.K., M.D., Veri Toplama veya İşleme: M.D., İ.S.K., M.K., T.İ., Analiz veya Yorumlama: M.K., D.G., T.İ., Literatür Arama: M.D., Yazan: M.D., İ.S.K.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.

Çıkar Çatışması: Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından TF.2009.D.12 no'lu proje olarak desteklenmiştir.


Resimler

  1. Craig PS, Rogan MT, Campos-Ponce M. Echinococcosis: disease, detection and transmission. Parasitology 2003;127:5-20.
  2. Gottstein B, Hemphill A. Echinococcus multilocularis: The parasite-host interplay. Exp Parasıtol 2008;119:447-452.
  3. Pawlowski ZS, Eckert J, Vuitton DA, Amman RW, Kern P, Craig PS, et al. Echinococcosis in humans: clinical aspects, diagnosis and treatment. In: Eckert J, Gemmell MA, Meslin F X, Pawlowski Z S. WHO/OIE on Echinococcosis in Humans and Animals: A Public Health Problem of Global Concern. Paris, 2002:20-69.
  4. Craig P. Echinococcus multilocularis. Curr Opin Infect Dis 2003;16:437-44.
  5. Vuitton DA, Zhou H, Bresson-Hadni S, Wang Q, Pıarroux M, Raoul F, et al. Epidemiology of alveolar echinococcosis with particular reference to China and Europe. Parasitology 2003;127:87-107.
  6. Torgerson PR, Keller K, Magnotta M, Ragland N. The global burden of alveolar echinococcosis. Plos Negl Trop Dis 2010;4:e722.
  7. Canda Ş. Canda T. Türkiye ekinokokkozis haritası ve kaynakçası. T Ekopatol Derg 1995;1:59-69.
  8. Özbilgin A, İnceboz T. Özcel’in Tıbbi Parazit Hastalıkları. In: Özcel MA, Özbel Y, Ak M. Alveolar echinococcosis İzmir: Meta basım, 2007:567-82.
  9. Miman Ö, Yazar S. Literatür ışığında Türkiye’de Alveolar Ekinokokkozis. T Parazitol Derg 2012;36:116-20.
  10. Parsak CK, Demiryurek HH, Inal M, Sakman G, Koltas IS, Erkocak EU, et al. Alveolar hydatid disease: imaging findings and surgical approach. Acta Chir Belg 2007;107:572-7.
  11. Carmena D, Benito A, Eraso E. The immunodiagnosis of Echinococcus multilocularis infection. Clin Microbiol Infect 2007;13:460-75.
  12. Kern P. Clinical features and treatment of alveolar echinococcosis. Curr Opin Infect Dis 2010;23:505-12.
  13. Reuter S, Nüsle K, Kolokythas O, Haug U, Rieber A, Kern P, Kratzer W. Alveolar liver echinococcosis: acomparative study of three ımaging techniques. Infection 2001;29:119-25.
  14. Can H, İnceboz T, Caner A, Şahar EA, Karakavuk M , Döşkaya M, et al. Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis’in Saptanması. Mikrobiyol Bul 2016;50:266-77
  15. Gottstein B. Echinococcus multilocularis: antigenic variance between different parasite isolates. Parasıtol Res 1991;77:359-61.
  16. Gottstein B, Jacquıer P, Bresnon- Hadni S, Eckert J. Improved primary ımmunodiagnosis of alveolar echinococcosis in humans by an enzyme-linked ımmunosorbent assay using the em2plus antigen. J Clin Microbiol 1993;31:373-6.
  17. Knapp J, Sako Y, Grenouillet F, Bresson-Hadni S, Richou C, Gbaguidi-Haore H, et al. Comparison of the serological tests ICT and ELISA for the diagnosis of alveolar echinococcosis in France. Parasite 2014;21:34.
  18. Bart JM, Piarroux M, Sako Y, Grenouillet Bresson-Hadni S, Piarroux R, et al. Comparison of several commercial serologic kits and Em18 serology for detection of human alveolar echinococcosis. Diagn Micr Infec Dis 2007;59:93-5.
  19. Liance M, Janin V, Bresson-Hadni S, Vuitton AD, Houın R, Piarroux R. Immunodiagnosis of  Echinococcus Infections: Confirmatory Testing and Species Differentiation by a New Commercial Western Blot. J Clın Microbiol 2000;38:3718-21.
  20. Georges S, Villard O, Filiseti D, Mathis A, Marcellin L, Hansmann Y, et al. Usefulness of PCR analysis for diagnosis of alveolar echinococcosis with unusual localizations: two case studies. J Clin Microbiol 2004;42:5954-6.
  21. Tappe D, Frosch M, Sako Y, Itoh S, Grüner B, Reuter S, et al. Close relationship between clinical regression and specific serology in the follow-up of patients with alveolar echinococcosis in different clinical stages. Am J Trop Med Hyg 2009;80:792-7.
  22. Tappe D, Grüner B, Kern P, Frosh M. Evaluation of a Commercial Echinococcus Western Blot Assay for Serological Follow-Up of Patients with Alveolar Echinococcosis. Clin Vaccine Immunol 2008;15: 1633-7.
  23. Korkmaz M, Inceboz T, Celebi F, Babaoglu A, Uner A. Use of two sensitive and specific immunoblot markers, em70 and em90, for diagnosis of alveolar echinococcosis. J Clin Microbiol 2004;42:3350-2.