Özgün Araştırma

Afrika Uyku Hastalığı Etkeni Trypanosoma brucei rhodesiense ve Amerika Chagas Hastalığı Etkeni Trypanosoma cruzi’nin Farklı Besiyerlerinde Üretilmesi ve Yeni Besiyerinin Denenmesi

10.4274/tpd.galenos.2019.6656

  • Ahmet Özbilgin
  • İbrahim Çavuş
  • Alicem Nuraydın
  • Yener Özel

Gönderim Tarihi: 22.11.2019 Kabul Tarihi: 30.11.2019 Turkiye Parazitol Derg 2020;44(1):7-11

Amaç:

Uyku hastalığı olarak da bilinen insan Afrika trypanosomiasisi, “Glossina”ların (çeçe sineği) insanı sokması ile bulaşan ve Trypanosoma b. rhodosiense ve Trypanosoma b. gambiense’nin etken olduğu bir parazit hastalığıdır. Parazit kültürleri, bilimsel çalışmalar için büyük önem arz etmektedir. Parazitin aksenik kültürlerde üretilmesi parazit biyokimyası, immünolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmalarda büyük avantaj sağlamaktadır. Bu çalışmada Trypanosoma b. rhodosiense ve Trypanasoma cruzi’yi bol miktarda üretecek besiyerinin saptanması ve yeni bir besiyerinin oluşturulması amaçlanmıştır.

Yöntemler:

Çalışmamızda, Manisa Celal Bayar Üniversitesi Parazit Bankası’nda saklanan Trypanosoma b. rhodosiense ve Trypanasoma cruzi suşlarının, sıvı azot tankından uygun koşullar altında çıkarılarak Besiyeri 1, Besiyeri 2, Besiyeri 3 ve yeni geliştirilen besiyerine (4) ekimleri yapılmıştır. Besiyerlerindeki üreme yoğunlukları zamana bağlı olarak Thoma lamında sayılmış ve Sidak’s multiple comparisons testi uygulanarak istatistiksel analizi yapılmıştır.

Bulgular:

Bu çalışma sonucunda gerek tanı gerek etken madde taramalarında, moleküler çalışmalarda, metabolik analizlerde ve ilaç çalışmalarında kullanılabilecek Trypanosoma b. rhodosiense ve Trypanasoma cruzi’yi bol miktarda üretecek en iyi besiyerinin 4 No’lu besiyeri olduğu kanısına varılmıştır.

Sonuç:

Bu çalışma, Türkiye’de Trypanosoma türlerinin üretilmesi ile ilgili yapılan ilk çalışmalardan biri olup Afrika Uyku hastalığı ve Chagas hastalığı ile etkenlerini çalışanlara temel oluşturmak amacıyla planlanmıştır.

Anahtar Kelimeler: Trypanosoma b. rhodosiense, Trypanosoma cruzi, besiyeri, tripanosomiasis, Türkiye

GİRİŞ

Uyku hastalığı olarak da bilinen insan Afrika trypanosomiasisi, Glossina’ların (çeçe sineği) insanı sokması ile bulaşan Trypanosoma brucei rhodesiense ve Trypanosoma brucei gambiense’nin etken olduğu bir parazit hastalığıdır. Trypanosoma brucei gambiense, Batı ve Orta Afrika’da yer alan 24 ülkede görülmektedir. Afrika Uyku hastalığı olarak bildirilen olguların %97’sinin etkenidir. Trypanosoma brucei rhodesiense, Doğu ve Güney Afrika’da yer alan 13 ülkede görülmektedir. Rapor edilen olguların %3’ünün etkenidir (1,2). Chagas hastalığı, Amerikan trypanosomiasisi olarak bilinen Triatoma cinsi böceklerin insanı sokması ile bulaşan ve Trypanosoma cruzi’nin etken olduğu bir parazit hastalığıdır. Genellikle vektör kaynaklı olarak 21 Latin Amerika ülkesinde görülmektedir. Dünya genelinde çoğu Latin olan 8 milyon insan enfekte durumdadır. Her yıl 10,000’den fazla insanın hayatını kaybettiği ve 25 milyondan fazla kişinin ise risk altında olduğu tahmin edilmektedir (3). Afrika Uyku hastalığının ve Chagas hastalığının tanısında kullanılan özellikle serolojik testlerin az duyarlı olması enfeksiyonlarda yanlış tanıya yol açmaktadır. Etken parazitlerin bol miktarda üretilmesi amacı ile aksenik kültürlerde parazitlerin üretilmesi gereksinimi vardır. Parazit kültürleri, bilimsel çalışmalar için büyük önem arz etmektedir. Bu çalışmada Trypanosoma b. rhodosiense ve Trypanosoma cruzi’yi kısa sürede ve bol miktarda üretecek besiyerinin saptanması ve yeni bir besiyerinin oluşturulması amaçlanmıştır.


YÖNTEMLER


Besiyerlerinin Hazırlanması

Besiyeri 1: Temiz bir balon joje içinde 200 mL distile su ile 10 g Bacto et sığır ekstratı 55 ˚C’ye ayarlanmış su banyosunun içerisine 1 saat bekletilmiştir. Sonrasında 5 g Bacto pepton ve 1,4 g sodyum klorid eklenmiş ve pH 7,2’ye ayarlanmıştır. Karışım iki balon jojeye ayrılarak birine 1 g agar eklenmiş ve her iki karışımda 121 ˚C’de 15 dk otoklavlanarak steril edilmiştir. Agar içeren besiyeri 50 ˚C’ye geldiğinde besiyeri içerisine 0,2 mL steril dekroz solüsyonu ve 5 mL tavşan kanı konulmuş ve steril cam tüpler içerisine 5 mL olacak şekilde yatık olarak katılaştırılmıştır. Cam tüp içerisinde donan besiyerinin katı formu üzerine 3 mL agar içermeyen sıvı formdaki besiyerinden eklenerek kullanılmaya hazır hale getirilmiştir.

Besiyeri 2: İki adet balon joje içinde 100 mL distile su içine 1,5 g Bacto triptose, 1 g liver broth, 0,2 g glukoz, 0,4 g sodyum klorid, 0,04 g potasyum klorid, 0,5 g sodyum fosfat tartılarak eklenmiş ve 121 ˚C’de 15 dk otoklavlanarak steril edilmiştir. Besiyerinin katı fazını oluşturacak jojelerin birine ek olarak 0,2 g agar ilave edilmiştir. Agar içeren ve yaklaşık 50 ˚C’ye soğutulan besiyerine 15 mL at serumu ve 2 mL 1/3 oranında eritrosit ile hazırlanmış hemoglobin süspansiyonu eklenmiştir. Steril cam tüplere 5 mL dağıtılarak yatık olarak soğumaya bırakılmıştır. Besiyerinin sıvı fazı için agar içermeyen besiyerine 6 mL at serumu ve 0,8 mL hemoglobin solüsyonu ilave edilmiş ve cam tüp içerisinde donan besiyerinin katı formu üzerine 3 mL eklenerek kullanılmaya hazır hale getirilmiştir.

Besiyeri 3: Besiyerinin katı fazı için, temiz bir balon içerisine 0,3 g meat ekstrat, 0,5 g Bacto pepton, 0,8 g sodyum klorid ve 1,5 g agar 100 mL distile su içerisinde çözdürülmüş ve 121˚C’de 15 dk otoklavlanarak steril edilmiştir. Yaklaşık 50 ˚C’ye soğutulan besiyerine 35 mL tavşan kanı eklenmiş ve steril cam tüplere 5 mL dağıtılarak yatık olarak soğumaya bırakılmıştır. Sıvı faz için ise, temiz bir balon içerisine 8 g sodyum klorid, 0,02 g potasyum klorid, 0,03 g monopotasyum fosfat, 0,02 g kalsiyum klorür ve 0,25 g glukoz 90 mL distile su içerisinde çözdürülerek pH 7,2-7,4 arasında ayarlanmış ve 121 ˚C’de 15 dk otoklavlanarak steril edilmiştir. Katı faz üzerine sıvı fazdan 3 mL eklenerek besiyeri kullanıma hazır hale getirilmiştir.

Besiyeri 4: Temiz bir balon içerisine 0,3 g meat ekstrat, 0,7 g maya eksrat, 0,3 g fruktoz, 0,4 g sodyum klorid, 0,3 g Bacto pepton ve 3 g agar 100 mL distile su ile çözdürülmüş ve 121 ˚C’de 15 dk otoklavlanarak steril edilmiştir. Yaklaşık 50 ˚C’ye soğutulan besiyerine 10 mL tavşan kanı eklenmiş ve steril cam tüplere 5 mL dağıtılarak yatık olarak soğumaya bırakılmıştır. Besiyerlerini kullanmadan önce sıvı faz olarak RPMI 1640+ %10 fetal bovine serum içeren sıvı besiyerinden 3 mL eklenerek kullanıma hazır hale getirilmiştir.


Besiyerlerinin Üreme Kapasitelerinin Karşılaştırılması

Manisa Celal Bayar Üniversitesi Parazit Bankası’nda sıvı azot tankında saklanan Trypanosoma brucei rhodesiense (ATCC PRA 407) ve Trypanosoma cruzi (ATCC 50825) suşları uygun koşullarda sıvı azot tankından çıkarılmıştır. Parazitler her bir besiyerinden 3 adet olmak üzere besiyerlerine ekimleri yapılarak Trypanosoma brucei rhodesiense suşu içerren besiyerleri 37 ˚C’lik etüve, Trypanosoma cruzi suşu içeren besiyerleri 27 ˚C’lik etüve inkübasyon için konulmuştur. Besiyerlerinde bulunan parazitlerin canlılık oranları 3., 5., 7., 9., 12. ve 14. günlerde Thoma lamı ile hesaplanarak besiyerlerinin üreme kapasiteleri karşılaştırılmıştır.


İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analizler için Sidak’s multiple comparisons testi uygulanmıştır.


BULGULAR

Trypanosoma cruzi’de 2 no’lu besiyerinde parazitlerin canlılıklarını 7. güne kadar sürdürdükleri daha sonra amastigot haline dönüşerek öldükleri gözlenmiştir (Grafik 1). Birinci, 3. ve 4. besiyerlerinde ise parazitlerin 12. güne kadar hızla artarak epimastigot formunda üredikleri (Şekil 1 ve 2), 12. ve 14. günde ise amastigot haline dönüşerek üremedikleri görülmüştür (Şekil 3). Birinci, ve 4. besiyerinde epimastigotların hareketlerinin daha hızlı olduğu ve daha çok ürediği gözlenmiş. On ikinci ve 14. günde epimastigotların daha az sayıda amastigota dönüştüğü görülmüştür. Trypanosoma b. rhodosiense’de ise 1., 2. ve 3. besiyerlerine yapılan ekimlerde ilk 3 gün parazitlerin canlı kaldığı ancak üreme fazına girmediği daha sonra tripamastigot olarak öldüğü görülürken (Grafik 2), 4. besiyerinde ise 9. güne kadar üredikleri daha sonra 12. ve 14. günlerde üremelerini durdurarak tripamastigot formunda öldükleri saptanmıştır (Şekil 4).

Trypanosoma b. rhodosiense ve Trypanosoma cruzi suşlarının Besiyeri 1, Besiyeri 2, Besiyeri 3 ve yeni geliştirilen (4) besiyerindeki üreme yoğunlukları zamana bağlı olarak Sidak’s multiple comparisons testi uygulandığında;

Trypanosoma cruzi için 1. günden 7. güne kadar her dört besiyerinde üreme hızı yönünden anlamlı bir fark görülememiştir (p>0,05). Dokuzuncu ve 12. günlerde ise 1 no’lu besiyeri 2 no’lu ve 3 no’lu besiyerine göre, 4 no’lu besiyeri 2 no’lu besiyerine, Besiyeri 4 Besiyeri 3’e göre üreme yoğunluğu istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). On dördüncü gün ise Besiyeri 2 ve Besiyeri 3 dışındaki diğer besiyerilerindeki üreme yoğunluğu istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Trypanosoma b. rhodosiense için ise 3. günde Besiyeri 2 ve Besiyeri 3 arasındaki üreme yoğunluğu açısından istatiksel olarak anlamlı bir fark görülmezken (p>0,05), diğer besiyerleri arasında üremede anlamlı bir fark görülmüştür (p<0,05). Beşinci, 7., 9., 12. ve 14. günlerde ise Besiyeri 1, Besiyeri 2, Besiyeri 3 ile Besiyeri 4 arasındaki üreme yoğunluğu istatistiksel olarak anlamlı bulunurken (p<0,05) diğerleri besiyerleri arasındaki üreme yoğunluğu anlamsız bulunmuştur (p>0,05).


TARTIŞMA

Trypanosoma türlerinin kültivasyonunda, besiyeri ortamının standardizasyonu ve parazitin beslenme gereksinimleri ile ilgili yeterli bilgi olmaması in vitro çalışmalarda zorluklar yaratmaktadır. Patojen özellikteki Afrika trypanosomalarının üretilmesinde denenen üç tip besiyerinde bir miktar başarı sağlanmıştır. Parazitler, kan içeren bifazik besiyerlerinde, hem besiyerinin sıvı fazında (4) hem de agar yüzeyinde koloni oluşturabilmektedirler (5). Parazitler, sıvı besiyerlerinde (6), sıklıkla kırmızı kan hücrelerin yüzeyinde toplanırlar. Ponselle ve Weinman tarafından biraz daha yoğun besiyerleri geliştirilmiştir. Ancak bu tip besiyerlerinde üremenin besiyerinin hangi bölgesinde olduğu belirtilmemiştir. Pek çok araştırmacı, tasarladıkları besiyerlerinin formülasyonunda insan kanı kullanmayı tercih etmiştir. Bu karşılık hayvan kanı kullanan araştırmacılar ise, bu kanın sürekli alt-kültürleri sürdürüp sürdüremeyeceği konusunda yeterli veriyi ortaya koyamamışlardır (7). Brucei grubunda bulunan türlerin üretilmesinin diğer trypanosoma türlerinden daha zor olduğu kabul edilmektedir. Yapılan çalışmalarla diğer trypanosoma türleri, çeşitli besiyerlerinde üretilmiş, beslenme kinetikleri ve metabolik özelikleri araştırılmıştır (8,9) fakat T. brucei’in üretilmesi konusunda yeterli başarı sağlanamadığı için çok az fizyolojik bilgi edinilmiştir.

Trypanosomatid türlerinin üretilmesi için kullanılan bazı besiyerlerinde (10,11), %10-30 oranında fetal buzağı serumu (FCS) kullanılmaktadır. FCS, yapısı tam olarak tanımlanmamış, değişken bir içeriğe sahip ve oldukça pahalı bir destekleyicidir. Birçok araştırmacı, FCS’ye alternatif olarak amino asitler, vitaminler, hormonlar ve sığır serum albümini gibi maddeleri besiyeri ortamına eklemiştir (12-14).

Trypanosoma brucei gambiense; Trypanosoma brucei brucei ve Trypanosoma brucei rhodesiense ile çok yakından ilişkili olmasına rağmen, sınırlı konak çeşitliliğinin olması, normal insan serumuna direnç göstermesi, insanda ve hayvan modellerinde farklı virülans özellikleri sergilemesi gibi temel mekanizmaları anlaşılamamış özelliklere sahiptir (15).

Trypanosoma brucei gambiense’nin kan dolaşımı formundaki tripomastigotların in vitro kültivasyonu için, çeşitli besiyeri bileşenleri, hayvan serumu, besleyici hücre katmanlarının ve bunların kombinasyonlarını kullanan çeşitli yöntemler tarif edilmiştir (16,17). Hirumi ve Hirumi (18) çalışmalarında, T. Brucei’nin sürekli kültivasyonu için (Hirumi’nin modifiye Iscove ortamı, HMI-9) aksenik besiyeri formülasyonu geliştirmişlerdir. Araştırıcılar, parazitlerin besiyerine uyum sağlama sürecinde, geniş çaplı bir hücre ölümüne uğradığını ve dolayısıyla sürekli kültivasyon öncesinde parazitlerin bir seleksiyona maruz kaldığını rapor etmişlerdir. Vassella ve Boshart (19), tarafından yapılan bir çalışmada sıvı aksenik kültürlerin aksine, katı HMI-9-agaroz plakları kullanılarak yapılan ilk kültürlerde parazitlerin büyük çaplı hücre ölümüne maruz kalmadığı bildirilmiştir.

Vassella ve ark. (20), yüksek molekül ağırlıklı ve düşük erime noktalı agaroz veya metilselüloz içeren HMI-9 besiyerinin, çeşitli pleomorfik yapıdaki T. b. brucei suşlarında anormal hücre bölünmesi veya inhibisyon olmadan üreyebildiğini bildirmiştir. Ayrıca bu besiyeri kültivasyon ve kriyostabilizasyon haricinde kan dolaşımı formundaki tripomastigotların dönüşümünde de etkilidir (21). Ancak, metilselüloz içeren besiyeri ortamında T. b. gambiense’in aksenik olarak in vitro kültivasyonu gerçekleştirilememiştir. Van Reet ve ark. (22), tarafından yapılan bir çalışmada, HMI-9 besiyerine metilselüloz ve insan serumu ilavesiyle non-gambiense ve gambiense suşlarının sürekli kültivasyonu araştırılmıştır. Araştırıcılar denenen besiyerinde T. b. gambiense dışındaki türlerin sıvı besiyerlerine göre daha iyi uyum sağladığını, T. b. gambiense suşlarının in vitro kültivasyonunda ise insan serumunun kritik rol oynadığını bildirmişlerdir.

Chagas hastalığının tanısında kan kültürü ve ksenodiyagnoz gibi yöntemler oldukça spesifiktir ancak kronik Chagas hastalığında gözlenen düşük parazitemi nedeniyle bu testlerin duyarlılığı düşüktür (23). T. rangeli’nin periferik kanda doğrudan gösterimi ile ilgili az sayıda çalışma bulunmaktadır (24). Bu metotların tanısal duyarlılığı ile ilgili literatürde yeterli veri bulunmamaktadır. Serolojik testler yüksek duyarlılığa sahiptir ancak T. cruzi ve T. rangeli antijenlerinin %60’ı homoloji gösterdiği için özgüllükleri yoktur ve sıklıkla çapraz reaksiyona yol açmaktadır. Bu durum endemik bölgelerde Chagas hastalığının spesifik tanısını zorlaştırmaktadır (25).

Leishmania donovani’nin (26) in vitro üretilmesi ve morfolojik dönüşümü için besiyeri ortamına vektörün idrarında bulunan sodyum ürat, ürik asit ve sisteik asidin eklenmesi, insan idrarının kullanımını da motive etmiştir. Ferreira ve ark. (27) yaptığı bir çalışmada, T. cruzi ve T. Rangeli’nin in vitro kültivasyonunda karaciğer infüzyonu triptoz ortamına insan idrarı ekleyerek besiyerinin performansını araştırmıştır. Araştırıcılar, hastalardan parazit izolasyonunda insan idrarının besiyeri duyarlılığını artırdığını bildirmişlerdir. Bu çalışmada elde edilen deneysel ve istatistiksel veriler incelendiğinde, gerek tanı gerek etken madde taramalarında, moleküler çalışmalarda, metabolik analizlerde ve ilaç çalışmalarında kullanılabilecek, Trypanosoma b. rhodosiense ve Trypanosoma cruzi’yi kısa sürede ve bol miktarda üretecek en iyi Besiyerinin 4 no’lu Besiyeri olduğu kanısına varılmıştır.


SONUÇ

Afrika Uyku hastalığının ve Chagas hastalığının tanısında kullanılan özellikle serolojik testlerin az duyarlı olması enfeksiyonlarda yanlış tanıya yol açmaktadır. Bu hastalıkların doğru ve zamanında tanı konması hasta sağlığı açısından büyük önem arz etmektedir. Bu nedenle yeni tanı kitlerinin geliştirilmesi ayrıca etken parazitlerin vektör ve konak üzerindeki biyokimyasal, immünolojik ve fizyolojik etkilerinin değerlendirilebilmesi için yapılacak çalışmalarda bol miktarda etken parazite ihtiyaç duyulmaktadır. Etken parazitlerin bol miktarda üretilmesi amacı ile aksenik kültürlerde parazitlerin üretilmesi gereksinimi vardır.

Parazit kültürleri, bilimsel çalışmalar için büyük önem arz etmektedir. Parazitin aksenik kültürlerde kısa sürede ve bol miktarda üretilmesi, parazit biyokimyasının, immünolojisinin, fizyolojisinin aydınlatılmasında ve moleküler tabanlı çalışmalarda büyük avantaj sağlayacaktır.

* Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışma için Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanlığı Sağlık Bilimleri Etik Kurulu’ndan 18/01/2018-E6260 tarih ve sayılı etik kurul onayı alınmıştır.

Hasta Onayı: Çalışmada kullanılan parazit suşları, Manisa Celal Bayar Üniversitesi Parazit Bankası’nda saklanan ATCC suşlarıdır. Hastadan izole edilmemiştir, bu nedenle hasta onamına gerek yoktur.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu içinde olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: A.Ö., Dizayn: A.Ö., İ.Ç., Y.Ö., Veri Toplama veya İşleme: A.Ö., İ.Ç., Y.Ö., A.N., Analiz veya Yorumlama: A.Ö., İ.Ç., Y.Ö., Yazan: İ.Ç., Y.Ö.

Çıkar Çatışması: Yazarlar çıkar çatışması bildirmemişlerdir.

Finansal Destek: Bu çalışma Manisa Celal Bayar Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 2018-004 numaralı proje ile desteklenmiştir.


Resimler

  1. Trypanosomiasis-human-african-(sleeping-sickness). www.who.int [Internet]. (cited 2019 February 5). Available from: URL: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/trypanosomiasis-human-african-(sleeping-sickness)
  2. Franco JR, Simarro PP, Diarra A, Jannin JG. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clin Epidemiol 2014;6:257-75.
  3. Rassi A, Rassi A, Marin-Neto JA. Chagas disease. Lancet 2010;375(9723):1388-402.
  4. Novy FG, McNeal WJ. On the Cultivation of Trypanosoma brucei. J Infect Dis 1904;1:1-30.
  5. Weinman D. Cultivation of African sleeping sickness trypanosomes on improved, simple, cell-free medium. Proc Soc Exp Biol Med 1946;63:456-8.
  6. Razgha A. Über die Züchtung der menschenpathogenen Trypanosomen. Zeitschrift fiir Parasitenkd 1929;2:55-66. Available from: URL: https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/BF02120353.pdf
  7. Reichenow E. Die Züchtung der patogenen Trypanosomen. Arch Schiffsu Tropenhyg 1934;38:292-302.
  8. Brutsaert P, Henrard C. L’hemoculture comme moyen auxiliaire de diagnostic de la maladie du sommeil. CR Soc Biol 1938;127:1469-72.
  9. Chang SL. Studies on Hemoflagellates. IV. Observations Concerning some Biochemical Activities in Culture and espiration of Three Species of Leishmania and Trypanosoma cruzi. J Infect Dis 1948;82:109-18.
  10. Hendricks LD, Wood DE, Hajduk ME. Haemoflagellates: commercially available liquid media for rapid cultivation. Parasitology 1978;76:309-16.
  11. Childs GE, McRoberts MJ, Moussa MA. Systems for the in vitro large-scale propagation of New World Leishmania. Ann Trop Med Parasitol 1979;73:395-6.
  12. Chaudhuri G, Ghoshal K, Pal S, Sen S, Banerjee AB. A new medium for large scale production of Leishmania donovani promastigotes for biochemical studies. Indian J Med Res 1986;84:457-60.
  13. O’Daly JA, Rodriguez MB. Differential growth requirements of several Leishmania spp. in chemically defined culture media. Acta Trop 1988;45:109-26.
  14. Kar K, Mukerji K, Naskar K, Bhattacharya A, Ghosh DK. Leishmania donovani: a chemically defined medium suitable for cultivation and cloning of promastigotes and transformation of amastigotes to to promastigotes. J Protozool 1990;37:277-9.
  15. Gibson WC. Will the real Trypanosoma b. gambiense please stand up. Parasitol Today 1986;2:255-7.
  16. Hirumi H, Doyle JJ, Hirumi K. African trypanosomes: cultivation of animal-infective Trypanosoma brucei in vitro. Science 1977;196(4293):992-4.
  17. Duszenko M, Ferguson MA, Lamont GS, Rifkin MR, Cross GA. Cysteine eliminates the feeder cell requirement for cultivation of Trypanosoma brucei bloodstream forms in vitro. J Exp Med 1985;162:1256-63.
  18. Hirumi H, Hirumi K. Continuous cultivation of Trypanosoma brucei blood stream forms in a medium containing a low concentration of serum protein without feeder cell layers. J Parasitol 1989;75:985-9.
  19. Vassella E, Boshart M. High molecular mass agarose matrix supports growth of bloodstream forms of pleomorphic Trypanosoma brucei strains in axenic culture. Mol Biochem Parasitol 1996;82:91-105.
  20. Vassella E, Krämer R, Turner CM, Wankell M, Modes C, van den Bogaard M, et al. Deletion of a novel protein kinase with PX and FYVE-related domains increases the rate of differentiation of Trypanosoma brucei. Mol Microbiol 2001;41:33-46.
  21. McCulloch R, Vassella E, Burton P, Boshart M, Barry JD. Transformation of Monomorphic and Pleomorphic Trypanosoma brucei. Methods Mol Biol 2004;262:53-86.
  22. Van Reet N, Pyana PP, Deborggraeve S, Büscher P, Claes F. Trypanosoma brucei gambiense: HMI-9 medium containing methylcellulose and human serum supports the continuous axenic in vitro propagation of the bloodstream form. Exp Parasitol 2011;128:285-90.
  23. Luz ZM, Coutinho MG, Cançado JR, Krettli AU. [Hemoculture: sensitive technique in the detection of Trypanosoma cruzi in chagasic patients in the chronic phase of Chagas disease]. Rev Soc Bras Med Trop 1994;27:143-8.
  24. D’Alessandro-Bacigalupo A, Saravia NG. Trypanosoma rangeli. Parasit Protozoa 1992;2;1-54.
  25. Saldaña A, Sousa OE. Trypanosoma rangeli: epimastigote immunogenicity and cross-reaction with Trypanosoma cruzi. J Parasitol 1996;82:363-6.
  26. Howard MK, Sayers G, Miles MA. Leishmania donovani metacyclic promastigotes: transformation in vitro, lectin agglutination, complement resistance, and infectivity. Exp Parasitol 1987;64:147-56.
  27. Ferreira KA, Lemos-Júnior PE, Lages-Silva E, Ramírez LE, Pedrosa AL. Human urine stimulates in vitro growth of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli. Parasitol Res 2007;101:1383-8.